超高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中維生素D3質量分數

樊垚，任國譜，王力清，綦艷，陳洪濤

(1.中南林業科技大學，長沙 410004；2.廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300；3.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連，116024)

0 引 言

維生素D是一種重要的脂溶性維生素，可參與人體內分泌系統對骨骼和無機鹽的代謝調節[1]，可由人體皮膚合成，合成量具有波動性[2]。嬰幼兒是維生素D缺乏的高危群體，我國嬰幼兒乳粉國標中維生素D含量要求為0.25～0.75 μg/100kJ[3-4]，允許的添加形式為維生素D2或維生素D3[5]，生產中為維生素D3[6]。乳粉中維生素D的測定多用液相色譜法[7-9]，樣品經皂化后用正、反相色譜測定。過程繁瑣，維生素D損失較大，不能反映維生素D實際質量分數。本文改進了嬰幼兒乳粉中維生素D測定方法，樣品低溫皂化后用超高效色譜測定。減少了損失，檢測結果良好，為實際生產檢驗中維生素D的確定和質量分數控制提供了更為有效的方法。

1 實 驗

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀 (二極管陣列檢測器，自動進樣器)；電熱恒溫振蕩水槽；Eyela SB-1100旋轉蒸發儀；Agilent Eclipse plus.1.8 μm，2.1×100 mm C18反相色譜柱。

1.2 材料

脂肪酶(Candida rugosa Lipase,1 468 U/mg)、無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉、氫氧化鉀固體、抗壞血酸(分析純)；維生素D2、維生素D3；甲醇(色譜純)；10 g/L抗壞血酸-乙醇溶液；濃度為0.01 mol/mL的KOH溶液。

隨機選取市售嬰幼兒Ⅰ段配方乳粉，標簽維生素D3含有量為9.6 μg/100 g。

1.3 方法

1.3.1 維生素D3標準液配制

準確稱取10 mg維生素D3，用乙醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，制備成質量濃度為100 mg/L維生素D3標準儲備液(冷凍儲藏，保質期3個月)。

1.3.2 樣品前期處理

稱取10 g乳粉樣品(精確到0.1 g)于250 mL具塞三角瓶中。加入1.5 g脂肪酶及20 mL溫水充分搖勻溶解，繼續加入80 mL抗壞血酸-乙醇溶液及20 mL的KOH溶液混勻，充氮排空氣后加塞蓋緊，置于恒溫振蕩器中(37±1)℃振蕩5 h(120 r/min)。 取出三角瓶后迅速降至室溫，將酶解皂化液轉移至250 mL分液漏斗中，三角瓶用少量石油醚淋洗后轉入分液漏斗中。加入100 mL石油醚，振蕩靜置后將水相轉入另一250 mL分液漏斗，按上述步驟第二次萃取。合并萃取液，水洗至中性。醚液用無水硫酸鈉過濾脫水，濾液轉入500 mL圓底燒瓶中，在旋轉蒸發器上35℃抽真空蒸至近干。殘渣用甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶。移取5 mL甲醇溶液于試管中，氮吹儀35℃吹干，加入1 mL甲醇，振蕩溶解殘渣，通過0.22 μm濾膜過濾，進超高效液相色譜儀分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus.1.8 μm,2.1×100mm C18反相色譜柱；流動相為甲醇-水(97∶3)；流速0.1 mL/min；檢測波長264 nm；進樣體積為10 μL。

2 結論與討論

2.1 線性關系

依次取0.2，0.5，1，2，5 mL及10 mL維生素D3標準儲備液于6個100 mL棕色容量瓶，各自用乙醇定容，制成質量濃度為0.2，0.5，1，2，5 mg/L 和10 mg/L的維生素D3系列標準工作液。直接進超高效液相檢測，以得到的峰面積為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果如圖1所示。

由圖1可以看出，維生素D3標準曲線的線性回歸方程為y=156.28x+15.178，相關系數R=0.9997，標準曲線在0.2～10 mg/L范圍內線性關系良好。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 流動相體積比

根據已有研究[10-12]，反相液相色譜測定維生素D3的流動相主要為甲醇。在實驗過程中發現，如果單純使用甲醇作為流動相，所有物質出峰時間提前，峰形有所重疊，分離效果不好。加入一定比例水作為流動相后，出峰時間有所延長，實驗比較了甲醇-水流動相比例分別為95∶5，97∶3和100∶1時的出峰情況， 結果如圖2所示。

發現當甲醇-水比例達到97∶3時，標準品峰形良好，樣品中維生素D3峰與其他干擾物達到較好的分離，沒有雜峰干擾。因此，選擇甲醇和水的體積比例為97∶3作為流動相比例。

2.2.2 流動相流速

由于超高效液相色譜使用1.8 μm，2.1×100mm C18反相色譜柱，長度較短，因此對流速有一定限制，流速過高時柱壓過大，分離效果會受到影響同時對色譜柱也有損害。一般最大流速為0.2 mL/min。實驗中選取0.2，0.15和0.1 mL/min分別進行實驗，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，流速在0.2 mL/min時，維生素D3峰形與雜質有所重疊，無法完全分離，流速為0.15 mL/min時也有類似情況，基線發生漂移。只有流速在0.1 mL/min時峰形完整，與其他雜質分離較好。因此，選取0.1 mL/min作為流動相流速。

2.2.3 色譜柱溫度

由于每次測定過程時間很短，色譜柱溫度整體來看對檢測結果影響不大，分別在30，40和50℃色譜柱溫度條件進行實驗，整體無明顯差異，出于保護色譜柱的考慮，選取30℃作為色譜柱溫度。

使用上述色譜條件對維生素D3標準品和嬰幼兒配方乳粉樣品進行了檢測，結果如圖4所示。

2.3 加標回收率

講已知含量的維生素D3標準品加入嬰幼兒配方乳粉樣品中，同時稱取乳粉空白平行樣。將所有樣品按上述方法進行前處理及后續測定，結果折算為IU/100 g(1 IU維生素D3=0.025 μg維生素D3)。 結果如表1所示。

表1 加標回收率實驗

2.4 精密度

對同一樣品在同一天內進行6次重復測定，結果如表2所示。

表2 精密度性實驗(n=6)

由表2可以看出，此方法用于維生素D測定，精密度良好。

2.5 最低檢出限

按實驗中的色譜條件下，以3倍信噪比(RSN)計為最低檢出限，得維生素D3的最低檢出限為0.2 μg/100 g。

3 結果與討論

(1)本文采用脂肪酶對嬰幼兒配方乳粉中的脂類物質進行分解，同時使用低溫皂化手段進行樣品前處理，最大程度的減少了維生素D的損失，提高了檢測回收率，同時省去了傳統方法中正相純化步驟，縮短了檢測時間。實驗中發現，適當延長皂化時間及提高皂化溫度，有助于最終峰形分離，但超過5 h之后無明顯變化，且溫度過高脂肪酶可能失活。因此最終確定37℃振搖5 h皂化。

(2)本文采用97:3的甲醇-水流動相，流動相流速為0.1 mL/min，色譜柱溫度為30℃，樣品加標回收率為93.4%，95.3%和96.5%(n=9)，精密度相對標準偏差為1.45%(n=6)，最低檢出限為0.2 μg/100 g。 通過對樣品隨機選取檢測發現，一些嬰幼兒配方乳粉中維生素D實際含量低于包裝標示值，可能與不同加工、儲藏等生產環節有關。

(3)利用超高效液相色譜儀進行物質分離檢測，將檢測時間控制在10分鐘之內，大大提高了檢測效率，可應用于嬰幼兒配方乳粉及其他同類食品中維生素D的檢測，值得推廣。

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[3]GB 10765—2010嬰兒配方食品[S].

[4]GB 10767—2010較大嬰兒和幼兒配方食品[S].

[5]GB 14880一94.食品營養強化劑使用衛生標準[S].

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