人參皂苷Rb1對大鼠實驗性心肌缺血再灌注損傷的保護作用

陳紅霞

(湖北科技學院基礎醫學院，湖北 咸寧 437100)

心肌缺血再灌注損傷(MRI)的概念最早由Jennings等［1］提出，在器官的缺血再灌注損傷中，心肌的缺血再灌注損傷發生率最高，也是目前研究最多的器官。再灌注損傷心肌可表現為心肌舒縮功能降低，再灌注性心律失常，心肌能量代謝紊亂和心肌超微結構的改變。但是缺血再灌注損傷的具體機制尚未完全闡明。自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、中性粒細胞、血管內皮細胞、細胞黏附分子與細胞凋亡等均可能參與缺血再灌注損傷的發生。大量的基礎研究證實缺血預處理能減少缺血再灌注損傷。研究表明人參皂苷Rb1有抗氧化，抗凋亡作用，并且能明顯縮小犬急性心肌梗死面積［2］，亦降低心梗大鼠血液粘度，還能降低心肌耗氧，改善冠脈循環［3～5］。但其對心肌缺血再灌注損傷保護的信號轉導機制未明。本研究通過人參皂苷Rb1預處理缺血大鼠心肌，觀察心肌梗死面積及心肌一氧化氮合酶表達的影響，探討其減輕心肌缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康雄性Wistar大鼠共40只，體質量220～260g，由湖北科技學院實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑

人參皂苷Rb1(中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號:1130-050102，純度≥98%);逆轉錄cDNA合成試劑盒(TOYOBO公司，由上海譜振生物科技有限公司代購);隨機引物合成(Invitrogen公司)，TaqDNA聚合酶、dNTP(Promega公司，由上海玉博生物科技有限公司代購);MDA、SOD及NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗方法

40只Wistar大鼠隨機分為空白組、再灌注模型組及人參皂苷Rb150mg·kg-1·d-1和100mg·kg-1·d-1組，每組10只。藥物組每天灌胃給藥1次，連續7d，空白組及再灌模型組給予等體積生理鹽水。參照DREXLER［6］方法，復制梗死模型。乙醚麻醉大鼠，從左側胸骨旁第3～4肋間開胸擠出心臟。在動脈圓錐和左心耳交界處高位結扎左前降支(LAD)后 ，將心臟放回原位，關閉胸腔。30min后松解LAD的結扎線，傷口局部給予青霉素粉劑抗感染，然后縫合皮膚。

1.4 心肌梗死范圍測量［7］

再灌注3h后再次阻斷冠狀動脈血流，注射伊文思藍進行心肌染色，以區分無藍色的缺血和藍色的非缺血組織。迅速將左室心肌取出切成約2mm的薄片，而后分離出未染色的心肌部分(無藍色)與染色部分(藍色)并用濾紙吸干，稱重，將缺血的心肌切片置于1%TTC磷酸緩沖液內，確定梗死組織范圍大小。然后再將灰白色區域(壞死區)和深紅色區域(非壞死區)進行分離后，分別測量并計算梗死/缺血的百分比(MIS)。

1.5 NO、SOD 活性及 MDA 含量的檢測［7］

取出處死后動物的左心室缺血心肌并研磨成10%的組織勻漿，移入離心管中(3500rpm離心15min)，吸取上清液(移液槍)，4℃儲存。用 NO試劑盒測定心肌組織勻漿NO活性，用MDA試劑盒測定心肌組織勻漿MDA含量，SOD試劑盒檢測SOD的活性。檢測均嚴格按照試劑說明書操作。

1.6 實時熒光定量PCR檢測不同組別心肌組織eNOS mRNA表達變化

引物序列設計如下:eNOS:296 bp，Sense:5＇TAGCTGTGCTGGCAT-ACAGG 3 ＇，Antisense:5 ＇ATGGTCAAGTTGG-GAGCATC 3 ＇;β-act in:159 bp，Sense:5＇CTTAGT-TGCGTTACACCCTTTCTTG 3 ＇，Antisense:5 ＇CT GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3 ＇，反應條件為:首先94℃ 3min變性，接著50個循環，包括94℃ 30s變性，56℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，最后72℃ 7min延伸。全過程在實時熒光定量PCR儀(FT C-2000)中完成，觀測并記錄擴增曲線并分析Ct值，根據Ct值計算出各擴增產物的相對表達量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠MIS及心肌組織SOD活性和MDA含量的變化

與空白組比較，再灌模型組大鼠MIS及MDA含量均顯著升高(P＜0.01);與再灌模型組比較，人參皂苷Rb150、100mg·kg-1組可見大鼠MIS明顯縮小 (P＜0.05或P＜0.01)，心肌組織MDA含量顯著降低 (P＜0.05或P＜0.01);與空白組比較，再灌模型組大鼠心肌組織SOD活性顯著下降(P＜0.01)，與再灌模型組比較，人參皂苷 Rb150、100 mg·kg-1組可見心肌SOD活性顯著升高(P＜0.05 或 P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠MIS變化和SOD及MDA含量比較(，n=10)

表1 各組大鼠MIS變化和SOD及MDA含量比較(，n=10)

與空白組比較，*P＜0.01;與再灌注組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 MIS(%) SOD(u/mg·ww) MDA(nmol/100mg·ww)0.36 ±0.49 6.13 ±0.65 3.76 ±0.23再灌注組 22.43 ±4.60* 4.67 ±0.79* 4.93 ±0.69*G-Rb150mg/kg組 14.98 ±4.31△ 5.98 ±0.96△ 3.95 ±0.61△G-Rb1100mg/kg組 13.89 ±4.72△△ 6.05 ±1.13△△ 3.81 ±0.36空白組△△

2.2 各組大鼠NO及eNOSmRNA表達的比較

與空白組比較，再灌模型組心肌組織NO及eNOSmRNA表達顯著下降(P＜0.05)，與再灌注模型組比較，人參皂苷Rb150、100mg·kg-1組可見心肌組織NO及eNOSmRNA表達顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，見圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NO及eNOSmRNA表達影響

3 討論

近年來心肌缺血再灌注損傷已經成為溶栓及動脈搭橋等冠脈再通術治療急性心肌梗死的重要難題之一，心肌缺血再灌注反而會加重心肌結構的損傷和功能障礙，甚至引起嚴重心律失常、猝死和心室纖顫等現象。研究表明，心肌缺血再灌注損傷會進一步加大MIS，其心功能障礙程度比急性心肌梗死還嚴重，病死率更高［8］。目前，缺血再灌注損傷發生的機制尚未完全闡明，研究表明自由基、鈣超載、細胞凋亡、中性粒細胞、血管內皮細胞、細胞粘附分子與心肌纖維能量代謝障礙等均可能參與缺血再灌注損傷。臨床對心肌I/R損傷的保護方法都是外源性的，如增加心肌氧和能量供應，減輕心臟負擔和能量消耗，但是所有的方法都有其不足和副作用。

經多年實驗研究和臨床應用表明，人參及其提取物人參皂苷能夠改善心肌缺血、縮小梗死面積，并且對再灌注損傷有著較好的保護作用［9］。本實驗結果進一步說明，人參及其提取物人參皂苷類藥物能夠上調eNOS進而增加NO的合成，具有快速反應性。從實驗數據可以看出，人參皂苷Rb1對心肌細胞存在確切的保護作用，理據如下:表1 中Rb150及100mg·kg-1組MIS均較缺血再灌注組小，而心肌組織MDA含量較再灌注組高，圖1中人參皂苷Rb1預處理組心肌SOD活性較再灌注組明顯增加。因此我們可以看出人參皂苷Rb1能夠通過上調eNOS的表達來抑制受損心肌細胞的壞死，從而發揮其藥效。但是目前無法確認人參皂苷Rb1調控eNOS表達的具體途徑，其機制仍需進一步的探討。

［1］Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al.My ocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog［J］.ArchPathol，1960，70:68

［2］睢大員，陳滿秋，于曉風，等.人參Rb組皂苷對犬實驗性心肌梗死的保護作用［J］.中草藥，2001，32(2):136

［3］Wu Y，Xia ZY，Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Mol Biol Rep，2011，38(7):4327

［4］覃秀川，睢大員，楊景文，等.人參Rb組皂甙對急性心肌梗死大鼠自由基代謝的影響［J］.吉林中醫藥，2002，22(3):51

［5］Thirunavukkarasu M，Han Z，Zhan L，et al.Adeno-sh-beta-catenin abolishes ischemic preconditioning-mediated cardioprotection by downregulation of its target genes VEGF，Bcl-2，and survivin in ischemic rat myocardium［J］.AntioxidRedox Signal，2008，10(8):1475

［6］Roque FR，Soci UP，De Angelis K，et al.Moderate exercise training promotes adaptations in coronary blood flow and adenosine production in normotensive rats［J］.Clinics(Sao Paulo)，2011，66(12):2105

［7］陳紅霞，趙小玉.普伐他汀配伍參麥注射液干預兔心肌缺血再灌注損傷的實驗研究［J］.咸寧學院學報(醫學版)，2007，21(2):96

［8］谷騰飛，趙明，蔣鵬，等.參麥注射液對缺血-再灌注損傷大鼠心肌H-FABP和血清FFA的影響［J］.臨床麻醉學雜志，2011，27(6):590

［9］Kong HL，Li ZQ，Zhao YJ，et al.Ginsenoside Rb1 protectneonatal rat cardiocytes against CoCl2-induced apoptosis in neonatal rats by inhibiting mitochondria permeability transition pore opening［J］.Acta Pharmacot Sinica，2010，31(6):687