黃芪預防小鼠急性酒精性肝損傷的作用機制研究

舒 慧，魏 蕾

(武漢大學基礎醫學院，湖北武漢430071)

酗酒易引起酒精性肝病，包括肝炎、脂肪肝和肝硬化，嚴重危害身體健康。近年來，酒精性肝病的發病率明顯上升［1］，受到廣泛的關注和重視。目前對該病的治療仍以戒酒、營養支持為主，西醫藥未有突破性進展，而多應用中醫藥治療。中藥黃芪具有補氣固表功效，能增強機體免疫力、增強造血功能、改善物質代謝、抗應激、延緩衰老、保肝和抗潰瘍等作用并已廣泛應用于臨床［2］。文獻報道，氧化應激是酒精性肝損傷發生和發展的重要原因之一［3］，本實驗觀察黃芪對急性酒精性肝損傷模型小鼠氧化應激的影響，探討黃芪的護肝作用機制，為本藥臨床應用于預防酒精性肝病提供實驗依據，現將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

①黃芪口服液的制備:黃芪購自湖北省咸寧市溫泉輔仁堂藥店，按文獻［4］法制成每毫升相當原生藥1g(1g/ml)的濃縮口服液，4℃保存。②實驗用酒:使用市售紅星牌二鍋頭酒，酒精度55%(v/v)，北京釀酒總廠出品，臨用前用雙蒸水稀釋成50%酒精濃度。③試劑與儀器:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號20100528)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號20100516)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20100425)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(批號20100421)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號20100419)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20100313)、總蛋白(TP)試劑盒(批號20100528)由南京建成生物工程研究所提供，其余試劑均為國產分析純。722型光柵分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 實驗動物

昆明種雄性小鼠60只，體質量(20±2)g，清潔級，由湖北醫學科學院實驗動物中心提供(合格證號:00011585)。動物實驗室條件:室溫(22±2)℃，濕度50% ～70%。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組給藥及造模

60只小鼠隨機分成4組，即正常組、模型組、黃芪低、高(0.5g/kg，1.0g/kg)劑量組，每組 15只，分別灌胃等容積生理鹽水和黃芪口服液，1次/d，連續7d。末次給藥后，除正常組外，其他各組灌胃50%白酒0.2ml/10g，1次/d，共3次，制備小鼠急性酒精性肝損傷模型。

1.3.2 指標測定

實驗結束后，禁食12h(不禁水)，將各組存活小鼠摘眼球采血，肝素抗凝，3000r/min離心10min，制備血漿。然后脫臼處死，取各組小鼠肝臟稱濕重，并用生理鹽水制備10%肝組織勻漿。按試劑盒說明書方法，分別測定血漿ALT和AST活性(賴氏法)，并測定肝組織SOD和GSH-PX活性及MDA、GSH和總蛋白(考馬斯亮藍法)的含量。

1.4 統計學處理

所有數據采用SPSS11.5軟件進行統計分析，計量資料采用s表示，組間顯著性差異性比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 一般情況

正常組小鼠毛發光澤，動作自如，反應靈敏，15只全部存活;模型組小鼠明顯嗜睡、倦怠、存活8只;黃芪低、高劑量組上述癥狀較模型組輕，分別存活8只和10只。χ2檢驗，4組間小鼠存活率無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 黃芪對酒精性肝損傷小鼠氧化應激的影響

見表1、表2和表3。

表1 4組小鼠血漿ALT和AST活性的比較(s，U/賴氏單位)

表1 4組小鼠血漿ALT和AST活性的比較(s，U/賴氏單位)

與正常組比較，△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05、##P＜0.01

36.16±15.12 60.25±5.72模型組 8 — 96.90±29.71△ 158.52±11.74△黃芪低劑量組 8 0.5 72.74±10.60△＊ 89.88±14.87△＊＊黃芪高劑量組 10 1.0 52.34±19.31＊＊# 65.43±6.19＊＊##ALT AST正常組 15 —組別 n 劑量(g/kg)

表2 4組小鼠肝組織SOD和GSH-PX活性的比較(s，)

表2 4組小鼠肝組織SOD和GSH-PX活性的比較(s，)

與正常組比較，△P＜0.05、△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.01;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05

組別 n 劑量(g/kg)SOD(nU/mg prot)GSH-PX(U/mg prot)48.63±2.26 302.17±19.45模型組 8 — 41.78±2.13△△ 190.21±16.50△△黃芪低劑量組 8 0.5 45.83±2.11△△＊ 236.67±11.18△△＊黃芪高劑量組 10 1.0 46.75±2.15△＊ 259.35±17.83△△＊#正常組 15 —

表3 4組小鼠肝組織GSH和MDA含量的比較(s，nmol/mg prot)

表3 4組小鼠肝組織GSH和MDA含量的比較(s，nmol/mg prot)

與模型組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.05、△△P＜0.05;與黃芪低劑量組比較，#P＜0.05

組別 n 劑量(g/kg)2.10±0.21 41.36±2.51模型 8 — 4.15±1.26△△ 33.54±3.23△△黃芪低劑量 8 0.5 2.81±0.71△＊ 37.61±2.74△△＊黃芪高劑量 10 1.0 2.69±0.78△＊＊ 41.92±3.65＊＊#MDA GSH正常 15 —

3 討論

眾所周知:酗酒易傷肝。為了探討中藥黃芪預防酒精性肝損傷的作用機制，本文采用白酒灌胃建立酒精性肝損傷的小鼠動物模型［5］，因ALT和AST是肝細胞內的主要功能酶，在肝組織損傷及壞死時，肝細胞膜和細胞器結構被破壞，膜的流動性失常，酶從細胞內漏出入血，故檢測造模后小鼠血中ALT和AST活性的高低可判斷其肝細胞損傷的程度［6］，本文模型組小鼠血漿ALT和AST活性顯著高于正常組，表明酒精性肝損傷的小鼠動物模型制備成功。有文獻報道［7，8］，酒精性肝損傷的致病機制與氧化應激關系緊密，氧化應激是指活性氧自由基導致機體組織的氧化損傷。在生理條件下，機體細胞經呼吸獲取氧，其中98%的氧與細胞器內的葡萄糖和脂肪相結合，轉化為能量，以滿足細胞活動的需要，另外2%的氧則轉化成氧自由基。氧自由基主要有活性氧(O-2)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)等。氧自由基的過氧化殺傷，主要是破壞細胞膜的結構和功能，破壞線粒體，斷絕細胞的能源，毀壞溶酶體，使細胞自溶［9］。一次性大量或長期過量飲酒，約90%酒精(主要成分是乙醇)在肝臟內氧化，除少量乙醇可在乙醇脫氫酶(ADH)和醛脫氫酶(ALDH)的催化下代謝生成二氧化碳和水排出體外，大量乙醇在ADH的催化下氧化轉變成乙醛。乙醛的毒性很強，與肝臟毒性密切相關，乙醛可通過黃嘌呤氧化酶轉變成超氧化物和氧自由基，乙醇還能誘導肝臟細胞色素P450酶活性增高，產生大量的活性氧簇，引發脂質過氧化，破壞肝細胞的結構和功能，造成肝損傷［10］;MDA是脂質過氧化反應過程中不飽和脂肪酸分解釋放出的反應性醛，是脂質過氧化的終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，致細胞腫脹、壞死，故檢測MDA含量的高低可反映肝臟損傷的程度［11］。機體存在著抗氧化系統，一類是酶系統，包括SOD、CAT、GSH-PX等;另一類是非酶系統，主要有GSH、維生素C和E等。生理狀態下，體內這些抗氧化系統可以及時清除氧自由基，保護組織細胞免受氧自由基的氧化損傷，但如氧自由基生成過多，超過了體內抗氧化系統的清除能力時，導致氧自由基過剩而蓄積，破壞了氧化/抗氧化的動態平衡，組織細胞遭受明顯的損傷和破壞，使機體病變及惡化，故檢測抗氧化系統的酶活性及GSH的含量變化亦可反映組織抗氧化應激能力的高低［12］。本實驗結果顯示:模型組小鼠MDA顯著高于正常組，而 SOD、GSH-PX和 GSH顯著低于正常組，表明小鼠急性酒精性肝損傷時肝臟組織存在著明顯的氧化應激;中藥黃芪可顯著降低血漿ALT和AST活性及肝組織中MDA含量;提高肝組織SOD和GSH-PX的活性和GSH含量;表明黃芪具有明顯的減輕酒精性肝損傷作用，機制可能與抗氧化應激作用有關，而且高劑量黃芪組GSH-PX活性和GSH含量明顯高于其低劑量組，呈現量效關系。本文為黃芪預防酒精性肝損傷及其機制的進一步研究提供了實驗依據。

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