法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)STR位點(diǎn)等位基因分型定值研究

趙興春， 孫 敬， 印 佳， 王 燕， 姜伯瑋， 高運(yùn)華， 葉 健

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；3.中科院應(yīng)用物理研究所，上海 201800；4.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

0 引 言

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）又稱(chēng)為微衛(wèi)星序列，是人類(lèi)基因組DNA中分布較為廣泛的一類(lèi)遺傳標(biāo)記，其核心序列一般由2～6個(gè)堿基組成，核心序列的重復(fù)單位數(shù)目不同構(gòu)成同一基因座中不同的等位基因。STR序列絕大多數(shù)分布于非編碼區(qū)，核心重復(fù)序列呈串聯(lián)排列，擴(kuò)增片段一般在400bp以下，因而更適合于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，目前在法醫(yī) DNA分析中得到了廣泛應(yīng)用[1]。法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種，具體是指具有特定量值的DNA測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，能夠保證法醫(yī)DNA分析結(jié)果的有效性和可靠性，同時(shí)確保實(shí)驗(yàn)室DNA分析結(jié)果的可比性及一致性[2-4]。目前，關(guān)于法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其相關(guān)定值研究鮮有報(bào)道，直接導(dǎo)致法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出現(xiàn)無(wú)法溯源的問(wèn)題，目前我國(guó)相關(guān)領(lǐng)域研究者已開(kāi)始關(guān)注DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究[5]。本文利用PCR方法對(duì)法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)備選所用細(xì)胞樣本的基因組進(jìn)行大量擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的STR等位基因分型片段，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行測(cè)序分析，獲得分型定值，以期為法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及溯源提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣本

人胚肺成纖維細(xì)胞（human pulmonary fibroblast，HPF）和人胚胃平滑肌細(xì)胞（human stomach smooth muscle，HSSM），購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；9947A購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 主要儀器

臺(tái)式離心機(jī)（賀利氏公司，Heraeus）；9700 型熱循環(huán)儀（Applied Biosystems公司）；超純水儀（Millipore公司）；SA-32型垂直電泳板（Whatman Biometra公司）。

1.3 主要試劑

低分子量 DNA Marker，購(gòu)自 NEB公司；DNATyperTM15試劑盒，購(gòu)自公安部物證鑒定中心；IdentifilerTM試劑盒和TaqGoldTM酶，購(gòu)自Applied Biosystems公司；丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰、硼酸、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、硫代硫酸鈉和氫氧化鈉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞樣本DNA的提取

細(xì)胞懸液離心去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1mL生理鹽水重新懸浮細(xì)胞，取細(xì)胞懸液加入EDTA-Na2溶液、10%SDS及蛋白酶K，進(jìn)行裂解。加入有機(jī)溶劑酚和氯仿，進(jìn)行抽提，去除蛋白等雜質(zhì)。吸上清于另一管，加入2.5倍體積冷無(wú)水乙醇，沉淀細(xì)胞DNA，加入TE緩沖液溶解DNA后4℃保存。

2.2 細(xì)胞樣本DNA單基因座STR擴(kuò)增

PCR 總反應(yīng)體積 10μL：5×PCR Mix 2.0μL、上/下游引物（見(jiàn)表1）各 0.2μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、細(xì)胞樣本DNA模板1.0μL、去離子水6.4μL。

PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃，11 min預(yù)變性；94℃，1min，59℃，1min，72℃，1min，總共 30 cycles；60℃，60min；25℃保溫。

表1 STR基因座引物序列

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及回收

將PCR產(chǎn)物于5%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)銀染顯色。將染色過(guò)后的凝膠晾干，從凝膠上切割回收目標(biāo)片段放入蒸餾水中，94℃溫浴20 min，使DNA片段從凝膠中釋放到水中。

2.4 目標(biāo)DNA片段大量擴(kuò)增及測(cè)序定值

取2μL含有目標(biāo)DNA片段的溶液作模板進(jìn)行大量擴(kuò)增（方法同2.2），產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)回收后送北京邁奧德恩生物公司測(cè)序。

3 結(jié) 果

3.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)

HPF、HSSM及9947A STR基因座分型結(jié)果見(jiàn)圖 1。STR基因座位點(diǎn)包括 D2S1358、D7S820、D8S1179、D13S317、TH01 及 CSF1PO。從圖中可以看出：HPF 在 D2S1358、D7S820、D8S1179、D13S317、TH01及CSF1PO均為雜合子；HSSM在D2S1358、D13S317、TH01 上為雜合子，在 CSF1PO、D7S820、D8S1179上為純合子。

圖1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

3.2 STR基因座位點(diǎn)等位基因片段定值

細(xì)胞樣本HPF和HSSM DNA STR基因座等位基因測(cè)序結(jié)果表明STR基因座等位基因核心序列均由4個(gè)核苷酸組成（圖2和圖3），定值結(jié)果顯示由于在基因座上核心序列重復(fù)數(shù)目不同，產(chǎn)生了相應(yīng)的等位基因（表2）。

表2 HPF和HSSM STR基因座等位基因定值結(jié)果

4 結(jié)束語(yǔ)

DNA是高等生物個(gè)體生物信息的遺傳載體，其本質(zhì)上是由A、G、C、T 4種堿基按照一定序列進(jìn)行排列組合而成的雙螺旋分子[6]。STR基因座位點(diǎn)核心序列亦是由上述4種堿基中的1種或幾種組成，重復(fù)數(shù)目的差異造成了同一位點(diǎn)出現(xiàn)不同的等位基因[7]。本研究利用PCR方法擴(kuò)增了法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)備選所用細(xì)胞基因組DNA，分離得到STR位點(diǎn)等位基因單個(gè)片段，經(jīng)測(cè)序得出每一片段核心序列的重復(fù)次數(shù)，依據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（ISFG）于2001年和2005年提出的《基于重復(fù)序列數(shù)目的等位基因命名指導(dǎo)原則》并且參照STR基因座的標(biāo)準(zhǔn)序列，最終得到了18個(gè)STR基因座的分型，測(cè)序定值結(jié)果與文中采用的商品化試劑盒分型結(jié)果全部一致，從分子水平上對(duì)STR分型的等位基因進(jìn)行了有效的定值。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在核心重復(fù)序列的側(cè)翼序列測(cè)序結(jié)果中，有部分位點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)參考序列不一致，這為復(fù)合擴(kuò)增試劑盒引物設(shè)計(jì)提供了參考，在設(shè)計(jì)擴(kuò)增這些基因座的引物時(shí)應(yīng)盡量避免出現(xiàn)突變的區(qū)域。

圖2 HPF DNA STR基因座等位基因測(cè)序結(jié)果

圖3 HSSM DNA STR基因座等位基因測(cè)序結(jié)果

從測(cè)序結(jié)果可以看出，法醫(yī)DNA分析中使用的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)STR分型定值最終追溯到了DNA組成的分子本質(zhì)，即4種堿基的排列組合以及這種組合在整個(gè)生物進(jìn)化過(guò)程中保存下來(lái)的重復(fù)數(shù)目的差異性[8]。因此，有理由相信在充分參考DNA分子組成本質(zhì)的基礎(chǔ)上，建立一套DNA分子的生物學(xué)基本國(guó)際單位以及相應(yīng)的定值標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)結(jié)合利用法醫(yī)遺傳學(xué)分析方法將法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源至基本單位，不僅可以有效解決法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溯源問(wèn)題，還有利于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間在實(shí)際操作中所用不同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)間的規(guī)范和統(tǒng)一，具有一定的理論和實(shí)踐意義。

[1]Butler J M.Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing[J].J Forensic Sci，2006，51（2）：253-265.

[2]Levin B C，Cheng H，Kline M C，et al.A review of the DNA standard reference materials developed by the National Institute of Standards and Technology[J].Fresenius J Anal Chem，2001（370）：213-219.

[3]孫輝，劉冰，高運(yùn)華．法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用[C]∥胡蘭.法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)展與應(yīng)用.北京：群眾出版社，2008：23-25.

[4]全浩，韓永志．標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)[M].2版.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：543-580.

[5]趙興春，印佳，孫敬，等.美國(guó)法庭科學(xué)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（4）：263-266.

[6]王鏡巖，朱圣庚，徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)[M].3版.北京：高等教育出版社，2002：71-95.

[7]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002：56-112.

[8]約翰·巴克爾敦.法庭科學(xué)DNA證據(jù)的解釋[M].唐暉，焦章平，譯.北京：科學(xué)出版社，2010：45-107.