川椒方治療小鼠變應性結膜炎的實驗研究

李素毅 高健生 接傳紅 宋劍濤 嚴 京

(中國中醫科學院眼科醫院，北京市石景山區魯谷路33號，100040)

變應性結膜炎(Allergic Conjunctivitis，AC)是最常見的眼表疾病之一，屬于中醫的“目癢”“癢如蟲行癥”“時復證”范疇，病情復雜難治。川椒方為高健生主任醫師的經驗方，臨床上取得了良好的療效。本研究通過建立小鼠變應性結膜炎的動物模型，選擇癥狀學、細胞學和血清免疫學中的較為重要的指標，驗證川椒方對變應性結膜炎的治療作用，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級Balb/c雌性小鼠，6～8周，體重18～20g。(中國醫學科學院動物實驗中心提供。動物合格證號:SCXK京2009-0007)。

1.2 主要試劑 OVA(美國 Sigma公司，A5503)，Al(OH)3(美國Sigma公司，A4682)，ELISA 試劑盒(美國R＆D公司，CK-E90529M)，川椒方水提液(中藥材購自北京燕北藥材公司，知母、地膚子、牛蒡子、川芎、川椒、防風等煎煮后取煎液蒸發濃縮)，鹽酸奧羅他定滴眼液(愛爾康公司)。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(日本久保田3740)，病理包埋機(北京海鷹達科技發展公司BMG-011)，病理切片機(德國LEIC-RM2235)，正置式顯微鏡+圖像分析系統(日本OLYMPUS-BX51)，全自動酶標儀(Rayto公司，RT-6000)。

2 方法

2.1 動物模型制備及實驗流程 參照Nakamura的AC小鼠模型方法［1］，balb/c小鼠進入動物房適應1周后開始實驗。1)致敏階段:于實驗第0天、7天、14天分別給予腹腔注射含OVA100μg與佐劑Al(OH)35mg共200μL的混合物使小鼠致敏。2)局部加強致敏:第15天至21天，每天每眼用OVA400μg溶于生理鹽水中點眼以加強致敏。3)激發:第24天將OVA(每眼400μg)溶于pH7.2的PBS液中滴入雙眼進行致敏原攻擊，以誘導AC癥狀。4)治療:第25天開始至31天治療7天。5)再次激發:7天治療結束后，再次OVA點眼局部激發，激發后20min觀察記錄AC超敏反應情況，24h后摘眼球法采血，處死動物，取結膜行HE、甲苯胺蘭染色，觀察切片變化并計數嗜酸性粒細胞數量;取血清，ELISA法檢測免疫球蛋白IgE、IgG1及免疫因子IL-4。

2.2 分組及處理 隨機分為6組，每組10只。1)空白組為非模型正常小鼠，生理鹽水灌胃;2)模型組為AC模型小鼠，生理鹽水灌胃;3)陽性藥物對照組:AC模型小鼠，鹽酸奧羅他定滴眼液點眼;4)、5)、6)組用AC模型小鼠，分別以5倍、10倍、20倍川椒方水提液灌胃。

2.3 體征評分標準 于點眼激發20min后裂隙燈顯微鏡觀察眼部體征。采取盲法由臨床眼科醫師分別對結膜水腫、結膜充血、眼瞼浮腫、分泌物產生4項指標的不同程度進行評分(0～3分)。最后將4項指標各自的分值相加得出總分，最低0分，最高12分。評分標準參照 Magone［2］、呂秋軍［3］、徐巖等［4］標準，改良后具體見表1。

表1 改良后體征評分標準

2.4 細胞計數方法 再次激發24h后放血處死小鼠并立即取材。眼球及眼瞼一同取出后10%中性甲醛溶液固定，制蠟塊，4μm連續切片，蘇木素 -伊紅(HE)、甲苯胺蘭染色，顯微鏡下計數嗜酸性粒細胞、觀察肥大細胞。

2.5 免疫血清制備 用摘眼球法采血，4℃恒溫離心，3000r/min，15min，-20℃冰箱中低溫保存。

2.6 統計學方法 采用SAS 8.02軟件進行統計，所有結果用均數±標準差(±s)來表示。多組間的比較采用完全隨機設計的方差分析。2組間的比較，采用t檢驗;所有統計檢驗均采用雙側檢驗。結果以P＜0.05為有統計學意義。

表2 裂隙燈下小鼠眼部體征評分(±s，n=10)

表2 裂隙燈下小鼠眼部體征評分(±s，n=10)

注:模型組與正常組相比，＊＊P＜0.01;川椒方各濃度組與模型組相比，△△P＜0.01;川椒方高濃度組與陽性藥物組相比，※P＞0.05;川椒方中、低濃度組與陽性藥物組相比，*P＜0.05。

1.60 ±0.84模型組 10.80 ±1.23＊＊陽性藥物組 5.50 ±1.08川椒方低濃度組 7.10 ±1.52△△＊川椒方中濃度組 7.00 ±1.25△△＊川椒方高濃度組 6.00 ±1.05組別 眼部體征積分正常組△△※

3 結果

3.1 AC小鼠模型觀察 模型較正常小鼠易激惹或倦怠，易脫毛。裂隙燈下觀察見瞼裂較小，充血水腫明顯，部分嚴重小鼠內眥部可見瘙癢后的抓痕。明顯畏光、流淚，黏液性分泌物增多，嚴重的浸濕全眼周皮毛。結膜充血呈烏紅色，血管迂曲，水腫明顯。病理切片顯示:結膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內嗜酸性粒細胞及中粒細胞浸潤，肥大細胞明顯增多，脫顆粒現象明顯。

3.2 川椒方的治療作用

3.2.1 臨床癥狀評分 見表2。模型組較正常對照組評分增高，各川椒方組體征評分值較模型組明顯降低，均具有統計學意義(P＜0.01);與陽性藥物對照組相比，高濃度組無統計學意義(P＞0.05)，低、中濃度有統計學意義(P ＜0.05)。

3.2.2 病理切片觀察川椒方對晚期炎癥的影響 見表3。1)結膜內嗜酸性粒細胞計數結果顯示:模型組小鼠結膜內細胞計數較正常組增高具有統計學意義;各川椒方組結膜內嗜酸性粒細胞數目較模型組明顯降低，其中，中濃度組和低濃度組與模型組比較具有統計學意義(P＜0.05)，高濃度組與模型組比較有統計學意義(P＜0.01);與陽性藥物對照組相比，高濃度組無統計學意義(P＞0.05)，低、中濃度有統計學意義(P＜0.05)。2)肥大細胞:模型組小鼠結膜內肥大細胞聚集增多脫顆粒明顯。治療后的各組以上特點都明顯減輕。其中高濃度組和陽性藥物組表象基本一致。

表3 川椒方對小鼠結膜嗜酸性粒細胞的影響(±s，n=10)

表3 川椒方對小鼠結膜嗜酸性粒細胞的影響(±s，n=10)

注:模型組與正常組相比，＊＊P＜0.001;川椒方高濃度組與模型組相比，△P＜0.01;川椒方中、低濃度組與模型組相比，▲P＜0.05;川椒方高濃度組與陽性藥物組相比，※P＞0.05;川椒方中、低濃度組與陽性藥物組相比，*P ＜0.05。

0.40 ±0.70模型組 24.50 ±5.62＊＊陽性藥物組 8.20 ±2.10川椒方低濃度組 13.90 ±2.60▲＊川椒方中濃度組 12.50 ±1.90▲＊川椒方高濃度組 8.60 ±1.51組別 嗜酸性粒細胞計數正常組△※

表4 ELISA檢測川椒方對AC小鼠血清指標的影響(±s，n=10)

表4 ELISA檢測川椒方對AC小鼠血清指標的影響(±s，n=10)

注:與正常組相比，★P ＜0.01;與模型組相比，▲P ＞0.05;與模型組相比，▲▲P ＜0.01;與模型組相比，●P ＜0.05;與陽性藥物組比，※P ＞0.05;與陽性藥物相比，△△P ＜0.01。

組別 IgE(μg/mL) IgG1(μg/mL) IL-4(pg/mL)正常組●※3.51 ±0.79 3.54 ±0.97 16.19 ±3.04模型組 7.53±0.84★ 9.13±0.62★ 26.32±5.53★陽性藥物組 4.27 ±0.69 4.71 ±0.52 22.88 ±4.02川椒方低濃度組 6.98 ±0.88▲△△ 8.77 ±1.86▲△△ 20.76 ±4.75●※川椒方中濃度組 5.33±1.21▲▲△△ 6.24±1.01▲▲△△ 20.27±3.77●※川椒方高濃度組 5.13 ±0.73▲▲※ 5.59 ±0.68▲▲※ 20.11 ±1.98

3.3 川椒方的作用機理 ELISA檢測血清指標顯示:1)模型組IgG1、IgE、IL-4升高，具有統計學意義(P＜0.01)。2)與模型組比較，中、高濃度組小鼠血清IgG1、IgE水平降低，具有統計學意義(P＜0.01)，低濃度組無統計學意義(P＞0.05);各濃度組IL-4均降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。3)與陽性藥物對照組相比，高濃度組IgG1、IgE無統計學意義(P＞0.05)，療效相當，中低濃度組比較有統計學意義，療效差于西藥組(P＜0.01);各濃度組IL-4均降低，與陽性藥物相比差異無統計學意義。結果見表4。

4 討論

變應性結膜炎是一種高發的眼表疾病，人群患病率約20%［5］。隨著環境變化、污染加重，發病率仍有增長的趨勢。局部用藥起效快，但作用不持久。長期用藥尤其是使用糖皮質激素類藥物會帶來干眼癥［6］、青光眼等嚴重并發癥。

川椒方是汲取《黃帝內經》、金代醫家劉完素學術思想“六氣發病皆從火化”的學術觀點，發揮中醫學整體觀念的治療優勢，靈活運用中醫的辨證法，將溫熱藥物川椒與寒涼藥物同用，去性取用，是用于治療AC的經驗方。作為內服中藥湯劑，川椒方能有效改善AC急性期各項癥狀，并能減輕晚期細胞反應帶來的損傷。不僅避免了局部用藥對眼表微環境的影響和嚴重的眼部并發癥而且對患者常合并的變應性鼻炎、哮喘等其他系統的變應性疾病癥狀起到改善作用。

AC反應機制復雜，涉及多種免疫機理及免疫因子參與。雖然機制尚不十分清楚，但I型變態反應為主，IV型變態反應參與作為基本機理是無異議的。起到了與西藥相當的療效，并且有其獨特的優勢，值得推廣和進一步研究。

［1］Nakamura，Takao MD.Detailed Criteria for the Assessment of Clinical Symptoms in a New Murine Model of Severe Allergic Conjunctivitis.Cornea，Volume 22(7)Supplement 1，October 2003，pp S13-S18.

［2］M.Teresa Magone，Chi-Chao Chan.A Novel Murine Model of Allergic Conjunctivitis.Clinical Immunology And Immunopathology，1998，87:75–84.

［3］呂秋軍.新藥藥理學研究方法［M］.北京:化學工業出版社，2007，433-434.

［4］徐巖，陳祖基.變應性結膜炎動物模型［M］.眼科研究，2001，19(2):181.

［5］Berdy GJ，Hedqvist B.Ocular allergic disorders and dry eye disease:asslociations，diagnostic dilemmas，and management.Acta Ophthalmol Scand Supp，2000，230:32237.

［6］Xiong C，Chen D，Liu J，et al.A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(5):1850-1856.

［7］宋劍濤，楊薇，高健生，等.川椒方治療過敏性結膜炎的臨床觀察.中國中醫眼科雜志，2010，20(1):17-19.

(2011-09-08收稿)