小鼠外周組織時鐘基因啟動子區甲基化分析

林慶玲，蔡彥寧，袁艷鵬，左曉虹

(首都醫科大學宣武醫院神經生物室，教育部神經變性病學重點實驗室，北京 100053)

迄今哺乳動物多個時鐘基因得到了鑒定，包括BMAL1、BMAL2、CLOCK、NPAS2、PER1、PER2、CRY1、CRY2及REV-ERBα等。時鐘基因對于生物節律的產生和維持發揮重要作用［1］。哺乳動物時鐘基因的節律表達不僅存在于視交叉上核，還存在于外周組織中如心、肝、腎、脾等［2-3］。PER1/PER2，CRY1/CRY2，CLOCK/NPAS2是旁系同源對。同時敲除旁系同源的兩個基因引起小鼠的晝夜節律喪失［4］。時鐘基因表觀遺傳調控在外周組織、癌細胞、腫瘤樣品以及圍產期發育中都有所研究［5-8］，這些研究表明，DNA甲基化可能調控正常機體發育和腫瘤發生中時鐘基因的表達。此外，時鐘基因甲基化狀態與路易體癡呆和老化有關［9-10］。

甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)是一種鑒定啟動子區甲基化狀態的簡單快速的方法［11］。而今未有關于小鼠時鐘基因啟動子區甲基化的報道，而小鼠是研究人類發育和老化必不可少的模型，所以應用MSP方法對小鼠時鐘基因啟動子區進行甲基化檢測非常有意義。本實驗設計了兩套MSP鑒定小鼠時鐘基因啟動子區甲基化，檢測了小鼠5個外周組織 8 個時鐘基因 PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1和BMAL2啟動子區甲基化狀態。

1 材料與方法

1.1 材料

QIAamp DNA mini kit(Qiagen，CA公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司);HS Taq(Takara公司);GelRed(Biotium，CA公司);SssI(CpG甲基化酶New England Biolab公司);引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 動物

清潔級C57BL/6雄性小鼠5只，8周齡，體質量18～20 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)-2007-004。按如下條件飼養2 周:飲食、飲水自由，08∶00開燈，20∶00關燈，照明:黑暗時間為12 h∶12 h。動物處理按照美國國立衛生研究院動物實驗指導方針和首都醫科大學實驗動物照料和使用委員會指導方針。5只小鼠在09∶00處死，分別獲得肝臟、心臟、腎臟、胸腺和睪丸組織。

1.3 基因組DNA提取和亞硫酸氫鹽處理

基因組DNA的提取按照QIAamp DNA mini kit說明書進行。偏重亞硫酸氫鈉和對苯二酚對基因組DNA進行修飾，將未甲基化的C轉化為U，而甲基化的C保持不變。基因組DNA最初的變性應用0.3 mol/L的NaOH。偏重亞硫酸氫鈉與對苯二酚的混合溶液(pH 5.0)與基因組DNA混合50℃孵育16 h。變性DNA的提取按照Wizard DNA purification resin說明書進行。加入0.3 mol/L NaOH在37℃孵育15 min結束反應，乙醇沉淀獲得DNA。

1.4 啟動子分析和引物設計

時鐘基因啟動子分析應用在線軟件(http://www.mspprimer.org/cgi-mspprimer/design.cgi)［12］。同一軟件設計時鐘基因啟動子區MSP引物，引物見表1和表2。應用在線軟件(http://www.urogene.org/methprimer)分析時鐘基因啟動子區轉錄起始位點上下游各600 bp長度序列。

1.5 甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)

偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA應用HS Taq(Takara，Japan)進行擴增。PCR產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳，GelRed(Biotium公司)染色。為了確定MSP特異性，SssI甲基轉移酶處理的基因組DNA作為陽性對照，未經偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為陰性對照。

1.6 MSP產物序列

PCR產物經北京華大基因研究中心測序。

2 結果

第一套引物檢測的8個時鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)啟動子區均為非甲基化狀態(圖1)。

第二套引物檢測的8個時鐘基因(PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1 和BMAL2)啟動子區均為非甲基化狀態(圖2)。擴增產物與預期片段大小一致。擴增產物經北京華大基因研究中心測序得到進一步證實(圖3，4)。

表1 時鐘基因啟動子區甲基化分析第一套引物Table 1 The first set of primers used for methylation analysis in the promoter of eight clock genes

表2 時鐘基因啟動子區甲基化分析第二套引物Table 2 The second set of primers used for methylation analysis in the promoter of seven clock genes

續表1

圖1 8個時鐘基因在肝、心、腎、胸腺、睪丸中第一套引物PCR產物電泳圖Fig 1 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using set I primers

圖2 8個時鐘基因在肝、心、腎、胸腺、睪丸中第二套引物PCR產物電泳圖Fig 2 Methylation analysis of eight clock genes in liver，heart，kidney，thymus and testis using setⅡ primers

3 討論

CpG島存在于啟動子區。MSP引物設計用于檢測時鐘基因啟動子區CpG島的CpG位點。因為甲基化特異性PCR只能檢測約3～4個CpG位點，因此容易出現假陰性MSP。為避免這個問題，除了PER1之外每個基因設計了兩對引物，用于擴增同一啟動子區不同的位點。

甲基化特異性PCR(MSP)是一種簡單快速和經濟的檢查檢測CpG島甲基化狀態的方法。對于每個MSP檢測，兩對引物中一對針對甲基化的DNA(M)，另一對針對非甲基化的DNA(U)。以前的研究表明，肝臟基因組DNA時鐘基因啟動子區為非甲基化狀態［5，13］。因此，偏重亞硫酸氫鹽處理的肝臟基因組DNA用于優化U引物對。肝臟基因組DNA依次經Sss I和偏重亞硫酸氫鹽修飾處理用于優化M引物對。正確大小的特定的擴增子得到了擴增。每個反應的PCR產物直接測序，鑒定了擴增產物和甲基化狀態。

結果表明，所有的CpG位點均為非甲基化狀態。作為陽性對照的SssI處理的基因組DNA均能得到擴增。該結果與先前的研究結果一致，表明成年鼠時鐘基因啟動子區為非甲基化狀態。有趣的是，一項先前的研究證明，PER1啟動子區存在一些顯著的甲基化。而該研究MSP方法鑒定了先前研究的不同的位點。確實，甲基化CpG位點在CpG島外并在第3和第4 E-box周圍［13］。

本研究鑒定了小鼠8個時鐘基因啟動子區甲基化狀態。檢測的小鼠外周組織肝、心、腎、胸腺、睪丸中時鐘基因啟動子區均為非甲基化狀態。本研究與先前的研究都表明，在成年小鼠外周組織中，時鐘基因啟動子區均為非甲基化狀態。

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