維持性血液透析患者血清誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡

王喜超，涂陽科，呂鳳巖

(天津市第一中心醫院腎內科，天津 300192)

在以往的研究中發現血液透析患者有血管新生［1-2］，本研究的前期中也發現血液透析患者血清體外可以誘導血管新生［3］，并且氧化應激是導致血管新生的一個因素［4］。尿毒癥血液透析患者更容易出現嚴重的心血管并發癥，新生血管的喪失而導致的血管功能代償不全可能為其原因之一。細胞凋亡是細胞的程序性死亡［5］，內皮細胞凋亡可能參與了尿毒癥患者新生血管的喪失。而目前未見相關文獻報道。本研究通過體外實驗，對其進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 對象

選取天津市第一中心醫院1998年09月至2008年10月的11例維持性血液透析患者及相同時期10例健康志愿者，所有對象均簽署知情同意書。血液透析患者平均年齡(63.2±4.4)歲，原發病為慢性腎炎、高血壓腎病和多囊腎等。所有患者均用碳酸鹽透析，每周透析3次，每次4.0 h。采用二醋酸纖維素膜透析器。健康對照組平均年齡(58.3±5.1)歲，均為健康志愿者。兩組的年齡、性別組成無統計學差異。

1.2 方法

1.2.1 血清的制備:透析患者在透析中動脈端采血，同時正常對照組清晨空腹采血，取血后立即低溫離心(4 000 r/min，20 min)，取上層血清 -70℃保存備用。分別把透析患者血清及健康志愿者血清混合進行實驗。

1.2.2 內皮細胞培養及實驗分組:HUVECs由重慶醫科大學組胚教研室惠贈(來源于美國ATCC公司)，內皮細胞常規培養于含100 mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養基(Gibco公司)，置于37℃ 5%CO2培養箱中孵育。細胞分為實驗組和對照組，實驗組用含100 mL/L透析患者血清的RPMI 1640培養基，對照組用含100 mL/L健康志愿者血清的RPMI 1640培養基。

1.2.3 形成血管樣結構的內皮細胞凋亡:把HUVECs接種于24孔培養板，經上述干預30和40 h，200倍光學顯微鏡下觀察血管樣結構形成與內皮細胞凋亡。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測內皮細胞增殖:把HUVECs以2×103/mL密度接種于96孔培養板，經前述培養及分組干預30和40 h后檢測，每孔加入 MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入 DMSO 150 μL，室溫震蕩10 min，在波長570 nm處用酶標儀測量吸光度A值。每組、每個檢測點設6個復孔，重復2次，結果取均值。

1.2.5 TUNEL法檢測內皮細胞凋亡:把HUVECs以2×104/mL密度接種于96孔培養板，經前述培養及分組干預40 h后用4%多聚甲醛固定細胞1 h，再分別用3%H2O2甲醛溶液和0.1%Triton X-100封閉及通透。TUNEL反應混合物37℃孵育1 h，酶標熒光素抗體37℃孵育30 min，DAB顯色。400倍光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數每個視野陽性細胞數目，取平均值。

1.2.6 比色法檢測內皮細胞內活性氧(ROS):把HUVECs以2×106個/L密度接種于48孔培養板，經前述培養及分組干預30和40 h后，棄上清，每孔加入200 μL蒸餾水，冰上吹打直至細胞溶解，每孔的200μL細胞裂解液按活性氧測定試劑盒(南京凱基生物)說明書檢測，最后計算各孔細胞產生活性氧的能力。每組、每個檢測點設6個復孔，實驗重復2次，結果取平均值。

1.2.7 Western blot法檢測內皮細胞caspase-3表達:把HUVEC接種于50 mL培養瓶，經前述培養及分組干預30和40 h后用PBS洗2次，加入細胞裂解液冰上吹打30 min，然后4℃ 12 000×g離心30 min，取上清用 BAC法進行蛋白定量。制備100 g/L SDS-PAGE 凝膠，蛋白加樣量40 μL，100 V電壓電泳2 h分離蛋白，然后用免疫印跡系統(20 mA，15 h)把蛋白轉到PVDF膜上。轉有蛋白的膜先用血清37℃封閉1 h，然后caspase-3 1∶300稀釋的一抗(Santa Cruz)37℃孵育2 h，再用1∶1 000稀釋的相應二抗37℃孵育1 h，最后用化學發光試劑顯示目的條帶，在美國Rio-Rad圖像分析系統中爆光成像。每一樣本重復5次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 形成血管樣結構的內皮細胞凋亡

內皮細胞培養30 h后，對照組無血管樣結構形成;實驗組有血管樣結構形成。培養到40 h后，對照組細胞數目較多，細胞生長狀態良好;實驗組形成血管樣結構的細胞逐漸由長梭形變為圓形，胞質粗亂，細胞開始松散、脫落，內皮細胞凋亡(圖1)。

圖1 內皮細胞培養40 h后形成的血管樣結構開始潰解Fig 1 Vascular networks collapse after endothelial cells exposed to serum medium for 40 hours(×200)

2.2 四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測內皮細胞增殖

實驗組內皮細胞培養40 h吸光度值低于對照組(P＜0.05);也低于30 h吸光度值(P＜0.05)(表1)。

2.3 TUNEL法檢測內皮細胞凋亡

內皮細胞培養40 h后，實驗組形成血管樣結構的內皮細胞陽性染色(胞核陽性或胞質、胞核都陽性)顯著高于對照組(P＜0.05)(圖2)。

2.4 比色法檢測內皮細胞內活性氧產生(ROS)

內皮細胞培養30和40 h實驗組內皮細胞產生的活性氧均高于對照組(P＜0.05)(表1)。

2.5 Western blot法檢測內皮細胞caspase-3表達

內皮細胞培養30 h后caspase-3表達兩組間無差異;培養40 h后實驗組內皮細胞caspase-3表達強于對照組 (P＜0.05)(表1，圖3)。

3 討論

本研究之前的研究發現，血液透析患者血清在體外培養內皮細胞30 h后可以誘導血管新生，在本研究中的體外實驗發現，內皮細胞培養40 h后，實驗組內皮細胞增殖能力減弱，細胞數量開始減少，血管樣結構潰解，新生為血管樣結構的內皮細胞出現凋亡，而沒有形成血管樣結構的內皮細胞沒有明顯凋亡，表明血液透析患者血清在誘導血管新生的同時，又誘導了所形成血管樣結構的內皮細胞凋亡，而這種凋亡導致了新生血管的喪失。新生血管的內皮細胞為什么出現凋亡，推測可能與以下因素有關［6-8］，首先，內皮細胞處于增生狀態時更容易凋亡;其次，內皮細胞的凋亡是新生血管重塑的重要機制;最后，尿毒癥毒素有促內皮細胞凋亡的作用。

表1 兩組內皮細胞培養30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相對內參表達比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

表1 兩組內皮細胞培養30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相對內參表達比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

＊P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 30 hours.

group optical absorptance ROS production casp-3 ex urs contr 0.952±0.045 1.085±0.047 10.16±8.0 pression 30 hours 40 hours 30 hours 40 hours 30 hours 40 ho 3 10.54±8.37 0.47±0.02 0.57±0.02 trial 1.073±0.046* 0.838±0.041*# 25.08±7.86* 39.20±9.41* 0.43±0.04 0.83±0.03*

本研究發現在內皮細胞培養40 h，即新生血管內皮細胞凋亡時，實驗組內皮細胞ROS產生明顯多于對照組，表明ROS在血液透析患者血清促新生血管內皮細胞凋亡中起作用。有研究［9］顯示，ROS在內皮細胞內可作為第二信使具有促細胞凋亡的作用，本研究結果與文獻報道一致。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶系(caspase)主要介導細胞凋亡反應，也參與炎性反應［10］。在本實驗中，血管樣結構形成時內皮細胞caspase-3表達未見增加，在內皮細胞培養40 h時，即形成血管樣結構內皮細胞凋亡時，caspase-3表達增加，說明caspase-3是這個凋亡過程的參與者。

因血管內皮細胞的凋亡而導致新生血管喪失可能進一步激活血小板和凝血系統，引起炎癥反應，加重毛細血管的塌陷及血管壁的纖維化和硬化，可能促進了血液透析患者心血管并發癥的產生。

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