P38 MAPK抑制劑對神經病理性疼痛大鼠脊髓TNF-α合成的影響

許 力，虞雪融，黃宇光

(中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院麻醉科，北京 100730)

痛覺過敏和觸誘發痛是神經病理性疼痛的突出特點，現有的治療方法效果十分有限［1］。大量研究發現，前炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能在神經病理性疼痛中發揮重要作用。例如，TNF-α作用于坐骨神經后可造成傷害性初級傳入纖維自發性興奮，并呈劑量依賴;外周神經損傷后脊髓背角中 TNF-α表達增加［2］。此外，TNF-α抑制劑可以緩解慢性壓迫性損傷(chronic constrictive injury，CCI)引發的痛覺過敏［3］。然而，參與脊髓TNF-α合成過程的信號傳導精確細節，尚未明確。體外培養的小膠質細胞在脂多糖誘導下可以產生大量TNF-α，而這一過程是通過脂多糖激活P38 MAPK通路完成的［4］。小膠質細胞是神經系統中的巨噬細胞，能夠產生釋放多種細胞因子，包括TNF-α。以往通過多種神經病理性疼痛模型證實，外周神經損傷后脊髓小膠質細胞中P38將被激活(激活的 P38形式為磷酸化-P38 MAPK，即 p-P38)［5］。由此可見，TNF-α 與 P38 之間可能存在著重要聯系，并且在神經損傷后的神經病理性疼痛形成過程中發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑材料

SPF級雄性SD大鼠，體質量160～200 g(北京維通科華實驗動物技術有限公司，合格證SCXK京2003220043)，12 h亮、暗間隔，適應性喂養1周后，開始進行實驗。P38抑制劑:4-(4-氟苯)-2-(4-甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1 氫-咪唑(SB203580)、抗β-actin抗體(Sigma公司)，蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液、辣根過氧化物酶標記二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素、抗TNF-α抗體和ECL發光試劑盒(Santa Cruz公司)，SDS-PAGE凝膠和醋酸纖維素膜(Bio-Rad公司)，抗磷酸化-P38抗體和抗總-P38抗體(Cell Signaling公司)生物素-親和素 SP試劑盒(Zymed公司)。

1.2 CCI模型建立

經中國協和醫科大學動物研究管理委員會批準，118只SD大鼠納入本研究。實驗分組包括:1)空白對照組(n=14)，2)假手術組(n=14)，3)CCI手術后未治療組(n=42)，4)CCI手術0.9%氯化鈉注射液治療組(n=24)，5)CCI手術P38抑制劑SB203580治療組(n=24)。第4和第5組，0.9%氯化鈉注射液或SB203580(2 μg，每天兩次)分別于手術前1天、手術后第1和第7天，鞘內注射入大鼠體內，持續注射7 d。

大鼠在戊巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉下進行CCI模型制作:在顯微解剖鏡下(放大倍數×40)暴露左側坐骨神經主干約7 mm，使用4-0羊腸線將坐骨神經松結扎4道，每個結相隔1 mm。結扎僅使坐骨神經輕度受壓［6］，然后逐層縫合傷口。沒有進行手術的大鼠作為空白對照，而假手術組大鼠僅暴露坐骨神經而并未結扎。

1.3 鞘內置管

鞘內置管于CCI手術前進行。戊巴比妥鈉麻醉下切除大鼠L6椎體，切開硬腦膜，將PE-10聚乙烯導管置入大鼠蛛網膜下腔約1.5 cm，使其恰好位于脊髓L3-4節段。小心縫合傷口，固定導管。鞘內置管后大鼠休息24 h再進行CCI手術。

1.4 Western blot

各組大鼠分別在CCI術后不同時點(3、7和14 d)麻醉下斷頭處死，快速取出其手術側腰膨大，勻漿后每個電泳道中放入30 μg總蛋白，采用SDSPAGE凝膠分離蛋白，然后轉移至醋酸纖維素膜上。濾膜在室溫下封阻約1 h后，在抗磷酸化-P38(p-P38)抗體、抗總-P38(total-P38)抗體、抗 TNF-α抗體以及抗β-actin抗體中，4℃孵育一夜。所得的印跡經二抗孵育1 h，在ECL試劑盒中顯影1 min，后暴露于 X線片上約1～10 min。磷酸化 P38和TNF-α的數據分別與各自樣本的β-actin在同一張濾膜上進行了內對照。

1.5 免疫組織化學

使用4%多聚甲醛灌注，小心完整取出大鼠腰膨大，使用固定液固定標本3～4 h，然后將標本置于25%蔗糖中過夜。冰凍切片機切取脊髓橫斷漂浮切片(片厚30 μm)，與抗磷酸化-P38抗體孵育，然后染色。

1.6 行為學分析

在進行基礎閾值測定前，大鼠將適應2周新的實驗環境。大鼠均置于架好的金屬網格墊上。測定腳掌機械閾值時，使用力度由0.2～26 g的一系列Von Frey細絲刺激大鼠后肢腳掌。將能夠引發大鼠縮足反應的最小力度認定為機械閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)［7］。各組大鼠均在手術前3天、手術當天(手術前即刻)、以及術后3、7和14 d測定 MWT。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 CCI術后脊髓P38被激活

CCI術后第3天開始脊髓背角p-P38水平明顯增高，并持續大約2周，而總P38(total-P38)水平沒有明顯變化(圖1)。免疫組化結果進一步證實，對照組大鼠脊髓背角p-P38水平明顯低于CCI組大鼠，CCI術后3 d脊髓背角p-P38染色強度和陽性細胞數量均明顯增加(圖2)。

2.2 CCI誘導脊髓TNF-α合成增加

與對照組和假手術組相比，CCI術后3、7和14 d脊髓背角TNF-α水平顯著升高(圖3)。

2.3 抑制P38活化能夠緩解CCI誘導的機械性觸誘發痛

與0.9%氯化鈉注射液治療組相比，SB203580預先給藥組和疼痛早期給藥組，CCI誘導的觸誘發痛得到顯著緩解，MWT明顯升高(P＜0.05)。然而，當CCI誘導的機械性觸誘發痛持續存在后，即CCI術后7 d時再給予上述SB203580鞘內治療，則不能有效緩解機械性觸誘發痛(圖4)。

2.4 P38抑制劑可以抑制CCI術后脊髓TNF-α合成

與0.9%氯化鈉注射液治療組相比，SB203580預先給藥組和疼痛早期給藥組，CCI誘導的脊髓背角TNF-α合成水平明顯下降(P＜0.05)。然而，當CCI誘導的機械性觸誘發痛持續存在后，即CCI術后7 d時再給予SB203580治療，則痛閾水平和脊髓TNF-α合成水平均無明顯改變(圖5)。

3 討論

本研究結果提示，鞘內注射SB203580并不影響基礎痛閾，但是預先或疼痛早期給藥則可明顯降低CCI誘發的病理性疼痛。然而，當疼痛持續存在后，P38抑制劑則無明顯鎮痛作用。另一項研究采用SNL模型得到了與本研究相似的結果，他們發現，只有在SNL手術前向大鼠鞘內輸注SB203580才能起到鎮痛作用，而SNL術后7 d給藥則無效果［8］。

圖1 CCI術后脊髓背角磷酸化P38 MAPK的Western blot檢測結果Fig 1 Western blot analysis for P38 MAPK in the dorsal horn of the spinal cord after CCI(±s，n=6)

圖4 不同時點鞘內注射P38抑制劑對CCI誘導的機械性觸誘發痛的影響Fig 4 The analgesia effect of intrathecal inhibition of P38 on CCI induced mechanical allodynia in different time point(±s，n=8)

本研究結果提示，CCI能夠誘導脊髓TNF-α合成增加。TNF-α作為一種前炎性因子在病理性疼痛形成過程中發揮著極其重要的作用:TNF-α注入正常背根神經節和大鼠肌肉均可誘導痛覺過敏;外周或中樞神經損傷后，腦和脊髓部位的TNF-α蛋白和mRNA 水平均增加［9－10］。

可見P38和TNF-α在神經病理性疼痛中均發揮著重要作用。本研究通過CCI模型觀察了脊髓中P38與TNF-α合成之間的關系。在多種神經病理性疼痛模型中，外周神經損傷后，脊髓小膠質細胞P38將被激活［11］。同時，脊髓中TNF-α水平也增加。小膠質細胞是脊髓中重要的巨噬細胞，可以釋放包括IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等在內的多種細胞因子［5］。本研究結果提示，P38抑制劑可以抑制CCI誘導的脊髓TNF-α合成。因此，推出下面設想:外周神經損傷后，脊髓小膠質細胞中P38通路被激活，活化后的小膠質細胞可以釋放大量細胞因子，包括TNF-α，從而引發疼痛。另一項研究證實了TNF-α與P38關系的另一面:他們向SNL模型大鼠腹腔內注射TNF抑制劑，發現TNF抑制劑可以抑制P38的活化，從而緩解了因SNL導致的觸誘發痛［11］。本研究因此得出結論:在脊髓中，P38活化與TNF-α合成互為因果，一方面活化的P38可以誘導TNF-α表達上調，另一方面大量合成的TNF-α也可以促使P38激活。

圖5 P38 MAPK抑制劑SB203580對CCI大鼠脊髓TNF-α合成的影響Fig 5 The influence of P38 MAPK inhibitor SB203580 on synthesis of TNF-α in spinal cord of rats with CCI(±s，n=8)

通過分析P38抑制劑的治療窗，本研究考慮P38更多地參與神經病理性疼痛的發生，而不是發展。CCI術后7 d，當神經病理性疼痛已經持續存在，大量細胞因子包括 TNF-α、IL-1、IL-6以及大量疼痛介質在脊髓中合成釋放［12］。正如前面所述，如此眾多的細胞因子可能激活P38通路，也有可能同時激活其他MAPK通路。因此，作為P38特異性抑制劑，SB203580無法在CCI引發的病理性疼痛持續存在數天后發揮鎮痛作用。

綜上，本研究證實P38抑制劑可以抑制CCI誘導的脊髓TNF-α合成。在CCI誘導的神經病理性疼痛中，P38 MAPK信號傳導通路作為重要因素參與TNF-α合成。

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