腺苷酸激活蛋白激酶在大鼠酒精性肝病中的表達(dá)減少

周東方，魏 峰，周俊英

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院感染科，河北石家莊 050051)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長(zhǎng)期大量飲酒所致的肝臟損害性病變，其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化［1］。ALD發(fā)病過(guò)程中存在脂質(zhì)代謝紊亂，脂肪在肝臟堆積［2］。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被稱為細(xì)胞的“代謝感受器”，參與多種代謝過(guò)程［3］。本研究擬通過(guò)觀察AMPK及其相關(guān)下游激酶在肝臟中的表達(dá)情況，探討AMPK在ALD發(fā)病過(guò)程的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200±20 g(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)708020)。AMPK-α2羊多克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)有限公司);乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)兔多克隆抗體(Abcam生物技術(shù)有限公司);固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBP)1c兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Taq DNA聚合酶(北京天根生物科技有限公司);AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司);AMPK、ACC、SREBP、β-actin引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及分組:隨機(jī)分出10只為正常對(duì)照組，其余動(dòng)物采用逐漸增加乙醇濃度和劑量的方法每日上午9時(shí)灌胃(乙醇濃度30% ～60%，劑量5～9 g/kg)，分別于 4、8、12和16 周末禁食12 h后股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物10、9、8和8只，分離血清低溫保存，新鮮肝組織冰凍切片;取部分肝臟左葉以10%中性甲醛固定;另取肝組織立即－80℃冰凍備檢［4］。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo):1)生化指標(biāo):測(cè)定肝功能ALT、AST、CHE 及血脂 TG、TC、HDL、LDL、VLDL 水平，應(yīng)用OLYMPUS AU-600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。2)病理學(xué)檢查:新鮮肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色，余肝組織標(biāo)本常規(guī)蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察肝組織普通病理變化。3)免疫組織化學(xué)染色法:采用PV法檢測(cè)AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白表達(dá)。肝組織蠟塊以3 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜，陰性染色用PBS代替一抗，滴加辣根酶標(biāo)記的二抗，置于37℃溫箱孵育30 min，光鏡下DAB顯色;蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸分化，氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。一抗工作濃度:AMPK-α2:1∶100;ACC:1∶80;SREBP － 1c:1∶100。在光鏡下按染色程度(0～3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分(1～4分為0% ～25%、26% ～50%、51% ～75%、76% ～100%)，最后將分?jǐn)?shù)相加。4)RT-PCR法:測(cè)定AMPK、ACC及SREBP mRNA的表達(dá)(表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行多組間方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。相關(guān)性分析用Pearson直線相關(guān)分析法。

表1 AMPK、ACC及SREBP的引物序列及反應(yīng)條件Table 1 The primers sequence and reactive conditions of AMPK、ACC and SREBP

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)指標(biāo)的變化

各且與正常對(duì)照組比較，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT和AST水平逐漸升高，CHE水平逐漸降低(P＜0.05，P＜0.01)(圖1);TG、TC和LDL水平逐漸升高，HDL水平逐漸降低(P＜0.05或P＜0.01)(圖2)。

圖1 大鼠血清ALT、AST及CHE的測(cè)定結(jié)果Fig 1 Serum level of ALT、AST and CHE of the rats

2.2 肝組織病理

各實(shí)驗(yàn)組肝組織脂肪變性明顯，肝小葉內(nèi)出現(xiàn)炎性壞死灶，至模型16周組大鼠肝細(xì)胞呈彌漫性小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成(圖3)。

圖2 大鼠血清TG、TC、LDL、VLDL and HDL的測(cè)定結(jié)果Fig 2 Serum TG、TC、LDL、VLDL and HDL of the rats

2.3 免疫組織化學(xué)染色

隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)AMPK-α2陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi) (圖4);ACC陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi) (圖5);SREBP陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，主要表達(dá)于肝細(xì)炎性壞死灶，至模型16周組大鼠肝細(xì)胞呈彌漫性小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并胞胞質(zhì)或胞核內(nèi)。與正常對(duì)照組比較(P＜0.05)(圖6，7)。

圖3 大鼠肝組織HE染色Fig 3 The liver tissue of rats(HE×400)

圖6 大鼠肝組織SREBP-1c的表達(dá)Fig 6 SREBP-1c expression of the rat liver(immunohisto-chemical staining×400)

圖7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠肝組織AMPK、ACC、SREBP的表達(dá)Fig 7 AMPK、ACC and SREBP of the rat liver by immunohisto－chemical method

2.4 RT-PCR

隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，AMPK mRNA表達(dá)量逐漸減少;隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，ACC、SREBP mRNA的表達(dá)逐漸增加。與正常對(duì)照組比較P＜0.05(圖8，9)。肝組織中 AMPK的相對(duì)表達(dá)量與 ACC及SREBP的相對(duì)表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。

3 討論

本研究顯示應(yīng)用乙醇灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型，該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃浴⒀仔苑磻?yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變［5］。病理染色顯示隨著血清TG、TC、LDL、VLDL逐漸升高，HDL逐漸降低，肝組織脂肪變性逐漸加重，提示乙醇灌胃可以造成大鼠脂質(zhì)代謝紊亂。喂食乙醇1周后大鼠肝小葉Ⅲ帶出現(xiàn)氧含量減少。肝組織缺氧的最早損害主要是通過(guò)中斷線粒體呼吸鏈的遞氫環(huán)節(jié)導(dǎo)致線粒體的供能障礙，使ATP減少和耗盡、氧自由基大量形成和脂肪酸氧化受阻，造成脂肪沉積于肝細(xì)胞，形成脂肪肝［6］。

圖8 RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織AMPK、ACC、SREBP mRNA/β-actin mRNA的表達(dá)Fig 8 AMPK、ACC、SREBP mRNA/β-actin mRNA expression of the rat liver with the RT-PCR method

圖9 RT－PCR檢測(cè)大鼠肝組織 AMPK、ACC、SREBP mRNA的表達(dá)Fig 9 AMPK、ACC and SREBP mRNA of the rat liver by RT－PCR

AMPK存在于線粒體內(nèi)，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，由α、β和γ 3個(gè)亞單位組成，α亞單位是AMPK的主要催化部位，其中α2主要分布于肝臟、骨骼肌和心臟。AMPK的活性主要受細(xì)胞中AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游的多種靶分子，當(dāng)AMP/ATP比值升高或降低分別調(diào)節(jié)分解代謝和合成代謝。ACC存在于胞質(zhì)中，是脂肪酸合成的限速酶，同時(shí)又是AMPK的下游靶分子，AMPK能磷酸化ACC的79位點(diǎn)蘇氨酸而使其失活［7］。SREBP是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核被膜上的膜連接蛋白，是參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟和脂肪細(xì)胞表達(dá)，AMPK抑制SREBP靶基因的表達(dá)，同時(shí)ACC又是SREBP的靶基因，因此AMPK可能在調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝中發(fā)揮著重要作用，其作用機(jī)制為通過(guò)激活A(yù)MPK，促進(jìn) ACC發(fā)生磷酸化而失活，并減少SREBP的表達(dá)，下調(diào)其靶基因在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從而抑制肝內(nèi)的脂肪合成過(guò)程，進(jìn)一步降低脂肪在肝臟中過(guò)度沉積所引起的脂毒性［8－9］。采用免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SREBP-1c陽(yáng)性著色由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，可能是由于 SREBP裂解激活蛋白，將SREBP-1c從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)護(hù)送到高爾基復(fù)合體，從而進(jìn)行裂解，經(jīng)過(guò)2步裂解后，SREBP-1c片段從膜上游離出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄。

本研究顯示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織病變加重，肝組織AMPK表達(dá)減少而ACC和SREBP的表達(dá)逐漸增加，且與AMPK呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性，提示ALD發(fā)病過(guò)程中AMPK表達(dá)減少，對(duì)ACC、SREBP活化的抑制作用減弱，導(dǎo)致脂質(zhì)合成增多，氧化分解減少，造成脂肪堆積，參與ALD發(fā)病機(jī)制的“第一次打擊”，可能是造成肝臟損傷的重要因素之一。

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