新城疫病毒感染活化的人肝星狀細胞系LX-2

李亞琳

(渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南 714000)

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)是單股負鏈RNA病毒，具有天然的在腫瘤細胞選擇性復制的特點。現在有一種觀點認為，NDV也可以在活化的非正常轉化細胞中高效復制。早在1976年就有報道，NDV能夠在活化的T細胞中復制，并導致活化T細胞的死亡;后來又有報道證明，NDV能夠在非正常轉化細胞中高效復制［1］。

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟的非實質細胞，其活化是肝纖維化發生的主要原因，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個新的研究熱點［2］。由于活化HSC也是一種非正常的、具有增殖能力的轉化細胞，本實驗以該細胞為出發點，探討溶瘤NDV在活化HSC中的復制情況，為肝纖維化治療以及肝癌的預防提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

人肝星狀細胞系LX-2(美國Mount Sinai醫學院Scott L.Friedman教授饋贈);重組NDFLtag-EGFP和溶瘤株 NDV-Italien(德國癌癥研究中心 Volker Schirrmacher教授饋贈)。NDFLtag-EGFP是由NDV LaSota株經過反向遺傳技術獲得，能夠表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)。

1.2 主要試劑

DMEM培養基(Hycolon公司);新生牛血清(中國杭州四季青公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);ReverTra Ace-α-TM(Toyobo公司);Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司);α-SMA、COLLAGENⅠ、TGF-β1 以及GAPDH引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成);重組人 TGF-β1(PeproTech Asia公司);雞抗NDV-HN一抗和兔抗雞IgY-FITC二抗(USBiological公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及條件培養基的制備:LX-2和小鼠原代培養HSC于37℃、5%CO2及飽和濕度下分別用DMEM(含5%或10%NBCS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)在培養箱中培養。

1.3.2 病毒的制備:將10 000 HU的NDV-Italien和NDFLtag-EGFP，按104～106倍稀釋，接種9～10日齡(溫度37℃，濕度60% ～65%的孵箱孵育9～10日)的無特異病原體(specific pathogens free，SPF)雞胚(梅里亞維通實驗動物技術有限公司，北京)，每只雞胚注射100 μL病毒到尿囊腔。繼續在溫箱中孵育3～4 d，每天翻蛋2次。第4天，將所有的雞胚置于4℃冰箱過夜以便于雞胚中的血液凝固，利于病毒收獲。

從4℃凍存的雞胚中吸出尿囊液，經低速離心，棄去沉渣，含NDV的上清液再經超速蔗糖密度梯度離心純化病毒。沉淀物用PBS重懸，血凝法測定NDV的滴度，并調整為5 000 HU，分裝，－70℃保存備用。

1.3.3 NDV的感染:細胞按一定密度接種在培養板中，過夜，待細胞完全貼壁后，用不含血清的培養液洗細胞2次，然后加入一定稀釋濃度的NDV，置培養箱中1 h。棄掉病毒液，再用不含血清的培養液洗細胞2次，換新鮮培養液繼續培養。

1.3.4 MTT檢測TGF-β對LX-2細胞的促增殖效應:LX-2細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，換成含0.5%NBCS的DMEM培養基饑餓24 h。TGF-β1用含有2%NBCS的 DMEM 分別稀釋成 2、1.5、1、0.5 和0.25 μg/L。對照孔不含TGF-β1。饑餓24 h后，細胞換上以上不同稀釋濃度的TGF-β1，每個濃度做3個復孔。繼續培養24 h后，每孔加5 g/L的 MTT［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide］溶液10 μL，4 h后，棄掉培養上清，每孔加100 μL的 DMSO，溶解形成的甲臢結晶，于490 nm分光光度法檢測細胞的吸光度值，并計算細胞增殖率，公式為:細胞增殖率=(實驗組細胞吸光度值－對照組細胞吸光度值)×100%/對照組細胞吸光度值。

1.3.5 半定量RT-PCR分析LX-2細胞的基因表達:LX-2細胞接種于6孔板中，按上述方法用含0.5%NBCS的DMEM培養基饑餓后，再用2 μg/L TGF-β1 刺激。24 h后，每孔加1 mL Trizol，置冰上裂解細胞5～10 min，收集裂解液到1.5 mL Eppendorf管中。根據Protocol提取總RNA，并用紫外分光光度計測定260 nm和280 nm處的吸光度值，計算RNA的含量和純度。

采用兩步法 RT-PCR檢測 α-SMA、COLLAGENⅠ和 TGF-β1的表達。首先每個樣品取2 μg RNA，Oligo(dT)為引物，反轉錄體系為20 μL，用 ReverTra Ace-α-TM試劑盒反轉錄形成第1股cDNA。運行條件是:42℃延伸30 min，99℃終止5 min。然后用rTaq polymerase和特異性引物(表1)進行PCR擴增。每個樣品取2 μL的反轉錄產物為模板進行PCR，反應體系25 μL，運行條件是:94℃ 預變性3 min，94℃變性30 s，不同退火溫度下引物結合30 s，72℃ 延伸30 s，35 個循環后，再72℃ 延伸10 min。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3.6 熒光顯微鏡技術觀察NDFLtag-EGFP在LX-2及原代培養的小鼠HSC細胞中的復制:HSC細胞在傳代培養過程中會自發活化，因此實驗用NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細胞和原代分離以及傳代的小鼠HSC細胞，觀察NDV在細胞中的復制情況。兩種細胞以1×105個/孔接種到6孔板(預鋪蓋玻片)。24 h貼壁后或用2 μg/L TGF-β1預刺激后，按照上述方法進行NDFLtag-EGFP感染，細胞繼續培養24 h，然后用熒光顯微鏡直接觀察NDV在細胞中的復制情況。1.3.7 流式細胞術定量NDFLtag-EGFP和NDVItalien在 LX-2細胞中的復制:NDFLtag-EGFP(1∶100稀釋)感染不同傳代的LX-2細胞，然后用流式細胞儀(flow cytometry，FACS)檢測熒光強度以定量NDV在細胞中的復制。對于NDV-Italien的感染，需要將 LX-2細胞以1×105個/孔接種到6孔板。24 h貼壁后，用含有0.5%NBCS的DMEM培養基饑餓24 h。然后用2 μg/L TGF-β1預刺激LX-2細胞使其活化，再用NDV-Italien(1∶500稀釋)感染細胞，24 h后消化細胞，并用雞抗NDV-HN一抗和FITC標記的兔抗雞二抗檢測NDV-Italien在LX-2細胞中的表達，并用流式細胞儀(flow cytometry，FACS)檢測NDV在細胞中的復制。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 TGF-β1對LX-2細胞的增殖影響

不同濃度的TGF-β1刺激LX-2細胞24 h后，MTT檢測細胞的增殖。TGF-β1促進LX-2細胞的增殖，且具有劑量依賴性，當其濃度為2 μg/L時，細胞增殖率為24.6%(圖 1A)。用2 μg/L TGF-β1 刺激 LX-2 細胞，RT-PCR 檢測顯示，細胞中 TGF-β1、α-SMA和COLLAGENⅠmRNA的表達均顯著上調 (P＜0.05)(圖1 B)。RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結果(表2)，數字為3次獨立實驗的平均值(±s)。

表2 RT-PCR電泳條帶的灰度掃描結果Table 2 The result of gray scanning for RT-PCR electrophoretic band

2.2 NDV在LX-2細胞中的復制

用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細胞，熒光顯微鏡觀察發現，在傳代次數多的細胞中病毒復制率高，而在傳代次數少的細胞中病毒復制率低(圖2A)。FACS分析顯示，NDV復制率從P1代的15.65%±0.92%增加到P16代的23.05% ±1.5%(圖2B)。進一步用FACS檢測了NDV-Italien在活化 LX-2細胞中的復制。LX-2細胞經2 μg/L TGF-β1刺激活化后，NDV在細胞中的復制率增加了1.8倍，NDV復制率從12.8% ±1.4% 增加到22.7% ±1.7%(圖2C)。

圖1 TGF-β1促進LX-2的活化Fig 1 TGF-β1 stimulated LX-2 cells to be activated

2.3 NDV在原代分離的小鼠HSC中的復制

用NDV感染分離的原代培養的小鼠HSC。結果顯示，隨著原代分離細胞培養時間的延長和傳代次數的增加以及 TGF-β1的刺激，細胞趨于活化，NDFLtag-EGFP在細胞中復制的效率也逐漸增加(圖3)。

3 討論

本實驗用到了兩株NDV，NDV-Italien和 NDFLtag-EGFP。NDV-Italien為野生型強毒株;NDFLtag-EGFP來源于弱毒株NDV-LaSota，其F基因進行了定點突變，并將EGFP基因插入在NP基因的上游，因此能夠直接通過熒光顯微鏡觀察病毒在細胞中的復制情況［3］。

肝組織中HSC細胞的活化是肝纖維化發生的關鍵。肝癌和肝硬化患者的肝組織中，α-SMA陽性的HSC大量浸潤也充分說明活化HSC在肝癌和肝硬化發展中的重要作用［4－5］。因此，靶向HSC的抗纖維化治療是一個重要的阻止肝癌肝硬化發生的有效途徑［6－7］。

HSC的活化有許多誘發因素，但受損的肝細胞分泌許多細胞因子來刺激其活化卻是最主要的原因之一。這些細胞因子中，最主要的是 PDGF和TGF-β1。TGF-β1主要是在HSC由靜止狀態到活化狀態的成肌纖維細胞的轉型過程中起作用，誘導HSC活化并產生過量的ECM進而形成肝纖維化［8］。因此本實驗用TGF-β1刺激LX-2使其活化。

實驗用不同的方法調查了NDV在LX-2細胞中的復制情況。因為LX-2細胞在培養的過程中可以隨著傳代培養時間的延長而自發的活化［9－10］，因此用NDFLtag-EGFP感染不同傳代的LX-2細胞，然后用熒光顯微鏡直接觀察或者用FACS分析NDV在細胞中的復制。結果證明，在傳代次數多的LX-2細胞中NDV的復制率越高，反之亦然。TGF-β1刺激LX-2細胞使其活化后，NDV-Italien在活化的LX-2細胞中的復制效率也大幅度提高。

為了進一步驗證這個結論，本實驗用NDFLtag-EGFP感染原代分離的小鼠HSC，也得出了一致的結果，即隨著培養時間的延長以及TGF-β1的刺激，細胞越趨于活化，NDV的復制效率也越高。所有這些結果證實了我們的假設，活化的HSC細胞更有利于NDV的感染，說明HSC細胞的活化易化了NDV在其中的復制。

NDV在臨床治療中因極少產生負面不良效應而成為腫瘤生物治療的一個安全平臺［11］。它能夠在腫瘤細胞和轉化細胞中選擇性復制的主要原因是能夠誘導內質網的應激壓力從而引起P53非依賴的細胞凋亡［12］。曾經有關于NDV能在活化的T細胞中復制并促進活化的T細胞凋亡的報道。本實驗雖然證明了活化的非正常轉化的LX-2細胞是NDV復制的一個靶標，但未能解釋HSC的活化之所以能夠易化NDV復制的機制，這是以后研究中有待解決的問題。

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