MMP-1、MMP-2在盆底器官脫垂疾病患者陰道組織中的表達及意義

王鳳玫，王長楠，宋巖峰*

(1.南京軍區福州總醫院婦產科，福建福州350025;2.第二軍醫大學生理教研室，上海 200433)

盆底器官功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是嚴重危害中老年婦女健康的一大疾病，主要包括盆底器官脫垂和尿失禁。研究表明，尿失禁與盆底器官脫垂具有相似的發病機制，是多因素作用的結果。女性生殖系統由盆底肌、韌帶、骨性骨盆所支撐。生殖泌尿系統機能的完整性和穩定性有賴于完整的、功能性的膠原蛋白纖維，這些纖維對于膀胱頸、尿道和盆底器官的穩定性具有重要作用。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與降解包括骨在內的全身各種組織細胞外基質的蛋白酶家族，包括基質中以及整合于質膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等。研究表明，膠原蛋白降解的增加與盆底器官功能障礙性疾病有關。多數研究對象為尿失禁患者宮頸或宮骶韌帶中金屬蛋白酶的表達情況［1－2］，主要以基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)為主，但 MMP-2亦可降解Ⅲ型膠原蛋白。本研究觀察盆底器官脫垂患者陰道前壁組織中MMP-1、MMP-2的表達，探討基質金屬蛋白酶與女性盆底障礙性疾病(PFD)的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

在獲得知情同意后，選擇2008年8月至2010年5月就診南京軍區福州總醫院的Ⅱ°以上(POP-Q評分)盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)需要手術治療的患者20例作為POP組，手術方式為保留或不保留子宮的全盆底重建術;以及同期因宮頸上皮內瘤變行全子宮切除但無SUI或盆腔臟器脫垂患者20例作為對照組。所選病例近3個月內均未服用雌激素類藥物，無生殖道和尿道的急性感染。各組患者均無類風濕類關節炎、甲亢等影響膠原代謝的疾病。兩組患者在年齡、產次、體重指數及絕經時間等方面無顯著性差異。脫垂組患者的平均年齡為(56.3±3.1)歲，對照組患者平均年齡為(58.1±3.4)歲。脫垂組與對照組患者的體重指數、產次以及絕經時間分別為:(20.9±2.4)/(21.4±2.4)kg/m2，(2.3±1.8)/(2.6±1.4)次，(7.8±3.2)/(7.1±4.2)年。

1.2 組織提取

對照組和POP組采用開腹子宮切除術和全盆底重建術，術中提取患者陰道前壁12點鐘處組織(1 cm×1 cm)放入標記的容器中，置－80℃低溫保存。

1.3 MMP-1.2 mRNA的表達

按Trizol試劑盒說明提取組織總RNA，取上述RNA樣品1.5 μg進行反轉錄反應，反應體系為20 μL，反應條件為37℃ 1 h，95℃ 5 min。取產物5 μL進行PCR擴增，MMP-1.2分別與內參照基因GAPDH的引物共管擴增。MMP-1的引物序列為:5'-GGAGCCCTGATGTTTCCC-3'及5'-ATGCGATTAC TACAGATACTGT-3';MMP-2引物為:5'-GCGGATCC AGCGCCCAGAGAGACAC-3'及5'-TTAAGCTTCCAC TCCGGGCAGGATT-3';GAPDH引物序列為:5'-TG TCTCCTGTGACTTCAACAGC-3'及5'-TGATGGTATT CGAGAGAA GGG-3';MMP-1.2及GAPDH預計擴增片段分別為346、646及326 bp。MMP-1反應條件為:94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 50 s，30個循環后，72℃延伸10 min。MMP-2 PCR參數為94℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s。30個循環后，72℃延伸5 min。通過凝膠圖像吸光度分析系統對PCR產物電泳條帶進行灰度掃描，計算MMP-1.2與GAPDH吸光度值的比值作為MMP-1.2 mRNA的相對表達量。

1.4 組織MMP-1.2活性分析

標本于液氮下粉碎、勻漿、離心，取上清液，以Centricon濃縮柱按體積比離心濃縮6倍，BioRad蛋白定量試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)定量、分裝。取20 μL上清液進行聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳，濃縮膠濃度50 g/L(pH 6.8)，分離膠濃度100 g/L(pH 8.8)。電泳后，凝膠于50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、5 mmol/L CaCl2、100 mmol/L NaCl、0.1%Triton X-100中浸泡振搖1 h，中間換液1次，不含Triton X-100的洗液洗5 min后，再用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、5 mmol/L CaCl2、200 mmol/L NaCl、0.2 g/L NaN3、10 mL/L Triton X-100 的孵育液37℃條件下孵育18～24 h，考馬斯亮藍R250染色，脫色，干燥封膠。通過凝膠圖像吸光度分析系統對結果進行灰度掃描，以平均吸光度(INT)和雜交信號面積(S)的乘積代表信號強度。

1.5 統計學分析

用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，組間用t檢驗。檢測結果均以均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 兩組患者陰道前壁組織MMP-1.2 mRNA的表達

脫垂患者陰道前壁組織中MMP-1 mRNA的表達明顯高于對照組(P＜0.01)(圖1，2)。

2.3 兩組患者陰道前壁組織金屬蛋白酶的表達

脫垂組患者陰道組織上清液中，活性形式MMP-1(42 ku)的表達明顯高于對照組(P＜0.05)。而活性形式的MMP-2(62 ku)表達無差別，但脫垂患者陰道壁組織中MMP-2酶原(72 ku)卻呈現高表達(P＜0.05)(圖3，4)

3 討論

隨著人口老齡化和對生活質量要求的提高，盆底功能障礙性疾病的發病率有增高的趨勢。據統計，60歲以上婦女的患病率可高達50%。目前很多研究認為，POP發生與盆底支持組織結構功能完整性的破壞密切相關，以機械性損傷如陰道分娩、陰道難產等引起的盆底肌肉、韌帶及筋膜的破壞為主。但有一些無陰道分娩的患者也會發生盆底器官脫垂，而且在大部分脫垂患者中，脫垂是在分娩數年后才發生。因此認為除了機械性損傷外，還有其他參與機制。年老或絕經患者宮骶韌帶的彈性明顯降低，膠原蛋白代謝明顯增強，進一步引起盆底肌肉及韌帶功能減弱，這些機制是受金屬蛋白酶控制［3］。膠原蛋白的異常代謝，膠原蛋白含量的減少、成分比例的改變以及金屬蛋白酶表達的增加均與壓力性尿失禁和盆底器官脫垂有關。壓力性尿失禁患者陰道壁組織中 MMP-1的表達明顯增強，而其抑制物TIMP-1的表達明顯降低［1］。而壓力性尿失禁與盆底器官脫垂具有相似的發病機制，那么盆底器官脫垂患者的陰道壁組織中MMP-1的表達是否也具有相似的趨勢呢?本研究檢測了MMP-1的mRNA表達，對其活性進行分析。結果表明，盆底器官脫垂患者陰道壁中MMP-1 mRNA的表達明顯增加，酶活性分析顯示結果與基因表達相一致。MMP-1活性增加的原因可能是因為基因表達和酶原合成增加有關。機體內生物酶發揮作用的同時亦有抑制物發揮著抑制酶活性作用。那么在脫垂患者中MMP-1酶活性抑制作用是否同時有所減弱，有待我們進一步去研究。

除了基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)外，研究表明，盆內筋膜中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)與盆底功能障礙性疾病的關系較密切。但有報道POP患者宮骶韌帶中MMP-2的表達與對照組對比無明顯差別［4］，POP患者宮骶韌帶中MMP-2的表達與對照組對比明顯升高［5］。作者認為可能此結果可能是由于入選患者的絕經狀態影響，因為性激素可以影響金屬蛋白酶的活性。作為與子宮關系密切的陰道頂端，脫垂患者中明膠酶的表達是否與宮骶韌帶一致。為了排除性激素的影響，本研究選取的患者均為絕經后。研究表明與參考文獻［4］研究結果相一致，POP患者陰道壁中MMP-2的表達與對照組對比無明顯差別。但有趣的是，在本研究中發現POP患者陰道前壁中MMP-2的前體pro-MMP-2的表達卻明顯增加，此現象的發生需進一步實驗研究。

以上研究表明，基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)通過降解膠原蛋白在生殖器官脫垂中發揮著重要作用，但MMP-1的高表達是否是脫垂發生的原因，仍需進一步研究證實。

［1］Chen Y，Desautel M，Anderson A，et al.Collagen synthesis is not altered in women with stress urinary incontinence［J］.Neurourol Urodyn，2004，23:367－373.

［2］Liapis A，Bakas P，Pafiti A，et al.Changes in the quantity of collagen typeⅠin women with genuine stress incontinence［J］.Urol Res，2000，28:323 －326.

［3］Reay Jones NH，Healy JC，King LJ，et al.Pelvic connective tissue resilience decreases with vaginal delivery，menopause and uterine prolapse［J］.Br J Surg，2003，90:466－472.

［4］Tomislav S，Marko V，Snjezana T，et al.Matrix metalloproteinases-1，-2 expression in uterosacralligaments from women with pelvic organ prolapse［J］.Marturitas，2009，64:132－135.