去卵巢大鼠腎臟組織表達(dá)FSHR和LHR

張 哲，鄭清蓮，劉永惠

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710061)

近年來發(fā)現(xiàn)，卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)、黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)可存在于性腺外組織如:脂肪［1］、骨組織［2］、平滑肌細(xì)胞、胃的壁細(xì)胞［3］、胰腺［4］、頜下腺［5］、某些惡性腫瘤細(xì)胞表面［6］等。

本實(shí)驗(yàn)曾發(fā)現(xiàn)［7－8］正常大鼠腎臟組織中有FSHR、LHR的表達(dá)，且表達(dá)量、基因序列與卵巢組織一致，那么是否具有和卵巢組織相似的表達(dá)調(diào)控特性?本實(shí)驗(yàn)旨在研究腎臟組織中FSHR、LHR的表達(dá)調(diào)控特性，從而探討腎臟是否具有和卵巢相似的功能和變化。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)SD雌性大鼠54只，未交配，體質(zhì)量為200～220 g，普通級(jí);孕19～21 d的SD雌性大鼠共100只［西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供合格證號(hào):SCXK(陜)2008-002］。RNAfast200(廣州飛捷生物有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);RT-PCR反應(yīng)體(廣州東盛生物科技有限公司);Quantityone分析軟件凝膠分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司);放免試劑盒(天津九鼎生物制品公司);苯甲酸雌二醇(西安化學(xué)試劑廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組:30只行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，余24只行假手術(shù)。

采用陰道細(xì)胞學(xué)檢查方法，陰道分泌物進(jìn)行HE染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察。證實(shí)卵巢摘除成功。

假手術(shù)組分為N1、N2和N3組各8只，模型組分為M1、M2和雌激素干預(yù)組各10只。N1組術(shù)后5日檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。N2和M1組術(shù)后1月檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。N3、M2和E組術(shù)后1月開始給藥:E組每周2次肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.1 mL/kg)，給藥結(jié)束即檢測(cè)指標(biāo)。

1.2.2 放免法測(cè)各組血清LH、FSH、E2和P水平:常規(guī)分離血清，4℃保存?zhèn)溆谩＜尤胂鄳?yīng)抗體，混勻，37℃溫育1 h，加入分離劑再混勻，4℃放置10 min，吸取上清液，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)(counts/min)，計(jì)算LH、FSH、E2和P含量。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組腎臟組織FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量:剪切腎臟皮質(zhì)組織。根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物;用fast法提取組織RNA;cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件:隨機(jī)引物，DEPC-treated 水，5 × 反應(yīng)緩沖液，dNTPmix，核糖核酸酶抑制因子，RevertiAid M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶;PCR擴(kuò)增體系:2×PCR TapMix，模板，上下游引物，DEPC水;FSHR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3 min，擴(kuò)增條件94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃ 10 min。LHR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3 min，擴(kuò)增條件94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃ 10 min。產(chǎn)物凝膠電泳，EB染色，觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定PCR產(chǎn)物的吸光度值，并與各自內(nèi)參相比。用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 陰道涂片結(jié)果

對(duì)照組陰道脫落細(xì)胞以多邊形表層細(xì)胞為主，胞質(zhì)紅染，胞核致密;模型組陰道脫落細(xì)胞以圓形底層細(xì)胞為主，胞質(zhì)藍(lán)染，顏色較深，胞核位于細(xì)胞中心，呈網(wǎng)狀(圖1)。

2.2 放免法測(cè)各組大鼠血清性激素水平變化

與N1組比較，M1組在術(shù)后1月E2、P水平顯著下降(P＜0.01)，M2組在術(shù)后2月E2、P有所升高，尤以P升高明顯(P＜0.01);與N1組比較，M1組在術(shù)后1月FSH、LH水平明顯升高(P＜0.05)，M2組FSH水平逐漸下降，但LH水平仍繼續(xù)升高(表1)。±s)

圖1 大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片觀察(HE×100)Fig 1 The vaginal smears of group A and B(HE×100)

表1 各組大鼠血清性激素水平Table 1 The serum levels of sex hormones(

2.3 RT-PCR半定量檢測(cè)各組大鼠腎臟FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

與N1組比較，M1組在術(shù)后1月FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)，M2組在術(shù)后2月FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)下降，尤以FSHR mRNA下降明顯(P＜0.05)，M1組顯著高于M2組 (P＜0.05)(表2，圖2)。

表2 各組大鼠腎臟組織中FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 2 The relative expressions of FSHR and LHR mRNA in rat kidney(±s)

表2 各組大鼠腎臟組織中FSHR mRNA、LHR mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 2 The relative expressions of FSHR and LHR mRNA in rat kidney(±s)

*P＜0.05 compared with group N1;#P＜0.05 compared with group M1;△P＜0.05 compared with group M2.

group amount FSHR mRNA LHRmRNA N1 8 0.916±0.175 0.223±0.065 N2 8 0.908±0.136 0.226±0.029 M1 10 0.801±0.634* 0.146±0.111*N3 8 0.911±0.144 0.221±0.058 M2 10 0.777±0.294# 0.137±0.051#E 10 0.514±0.249△0.136±0.061

3 討論

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)時(shí)會(huì)發(fā)生性激素水平降低的病理變化，眾多學(xué)者普遍認(rèn)為其是通過影響下丘腦-垂體-性腺軸形成的。

有報(bào)道［13］腎衰患者發(fā)生排卵障礙和月經(jīng)紊亂等，與腎衰的嚴(yán)重程度相平行，他們測(cè)定了腎衰透析與未透析兩組患者及健康獻(xiàn)血者血清FSH、PRL、E2、P和LH的水平。結(jié)果提示，透析并不能改善腎衰患者的內(nèi)分泌狀況。同時(shí)又有報(bào)道［9］，給予腎衰血液透析患者促性腺激素釋放激素或拘椽酸克羅米芬后，血清LH及FSH水平相應(yīng)地增高，提示下丘腦-垂體功能未受損害。

圖2 各組大鼠腎臟組織中FSHR和LHR mRNA表達(dá)Fig 2 The FSHR and LHR mRNA expression in rat kidney

由此，如果是毒素影響下丘腦以及性腺的功能，而CRF患者下丘腦-垂體功能本身未受損害，那么規(guī)律血液透析后其內(nèi)分泌狀況為什么沒有改善，而腎移植術(shù)后，患者的性激素水平明顯提高、性功能也得到了恢復(fù)?所以毒素影響學(xué)說以及下丘腦-垂體-性腺軸功能的紊亂已經(jīng)不能為腎衰性激素水平減退做出合理的解釋，因此要尋求其他作用途徑來明確這一現(xiàn)象，但目前國內(nèi)外對(duì)此研究甚少。

前期的實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)正常大鼠腎臟中有FSHR和LHR的表達(dá)，且其表達(dá)量、基因序列與卵巢組織一致;且國外研究報(bào)道大鼠腎臟組織中存在參與和調(diào)節(jié)性激素合成的 17β-HSDs［10］、StAR 及SF-1［11］因子;并有實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到大鼠腎臟中有性激素的分泌［12］，據(jù)此設(shè)想，腎臟是否具有和卵巢組織相似的內(nèi)分泌功能，從而參與性激素合成和調(diào)節(jié)過程?并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腎臟和卵巢中，F(xiàn)SH和LH對(duì)其受體表達(dá)的雙相調(diào)節(jié)是一致的。低劑量FSH和LH提高FSHR mRNA和LHR mRNA水平;而高劑量FSH和LH下調(diào)FSHR mRNA和LHR mRNA水平。高劑量的雌激素可導(dǎo)致FSHR mRNA水平的顯著下降。

大鼠腎臟中的FSHR和LHR的表達(dá)量、基因序列以及表達(dá)調(diào)節(jié)特性與卵巢組織極為相似，說明腎臟組織有可能通過FSHR、LHR，參與性激素合成和調(diào)節(jié)過程，但其是通過什么途徑參與和調(diào)節(jié)的?推測(cè)腎臟自身是否存在一條類似下丘腦-垂體-性腺的調(diào)節(jié)軸(The hypothalamus pituitary gonadal axis，HPGA)參與性激素的合成與代謝過程。本研究結(jié)果不但能豐富腎臟的生理功能，還為治療腎衰性激素水平減退提供新的思路和方法。

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