靶向VEGF的shRNA對皮膚鱗癌A431細胞的作用

曹一鑫，馮 新，王建力，陳 莉

(1.南通大學附屬醫院皮膚科，江蘇南通226001;2.海門市皮膚病防治醫院;3.南通大學醫學院病理學系，江蘇南通 226001)

隨著現代分子生物學的發展，從基因水平上探索防治皮膚鱗癌的新途徑已日益成為國內外研究的熱點，其中RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是目前最有希望攻克腫瘤的方法之一［1－2］，將為皮膚鱗癌未來的臨床治療開辟一個新的領域。本研究擬通過RNAi技術沉默人皮膚鱗癌細胞系(A431細胞)中VEGF基因，觀察癌細胞增殖、遷移和黏附的改變，為進一步開發以VEGF基因為靶點的皮膚鱗癌基因治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚鱗癌細胞(A431)由西安第四軍醫大學附屬西京醫院高天文教授惠贈。PCR Maker(Tiangen公司);脂質體(Invitrogen公司)，DMEM培養基及胎牛血清(Gibco公司)，PCR試劑盒、DNA連接試劑盒、分子質量標記和限制性內切酶(寶生物工程有限公司)。EILSA試劑盒、FN、鼠抗VEGF單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz公司)，CCK-8(日本同仁公司)，Transwell小室(Coastar公司)。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建:利用Qiagen siRNA設計軟件，根據基因庫中的VEGF序列設計2個靶位點的VEGF shRNA序列(55 nt的寡核苷酸)［3］。通過真核表達載體pSilencer4.1-CMVneo構建靶向VEGF基因的shRNA表達載體(psilencer-VEGF-shRNA，VEGF-s1和VEGF-s2)。同法構建與人類任何基因序列均無同源關系的隨機靶序列作為陰性對照表達質粒(Target-off-shRNA，T-off)，設計質粒序列見表1。

1.2.2 實驗方法:取對數生長期細胞接種于100 mL培養瓶中，待細胞生長至90% ～95%匯合時，參照試劑盒說明書進行細胞轉染。設未轉染的A431細胞為對照組(N)。1)實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(real-time qutant RT-PCR，RT-QPCR)檢測A431細胞中VEGF mRNA的表達，VEGF引物序列:上游:5'-ATGCGGATCAAACCTCACCA-3'，下游:5'-TTACACGTCTGCGGATCTTG-3'，內參GAPDH引物序列:5'-CGAAGTCAACGGTGGTCGTAT-3'，下游:5'-AGCCTTCTCGGT GGTGAAGAC-3'，反應條件:95℃7 min，95 ℃ 變性20 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，45個循環，最后72℃延伸7 min。2)ELISA檢測A431細胞中VEGF分泌蛋白的表達。3)Western blot檢測A431細胞中VEGF蛋白的表達。選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度(A)值。4)流式細胞儀檢測細胞周期，細胞增殖指數(Proliferation Index，PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。5)細胞劃痕法檢測細胞二維空間遷移情況，在倒置顯微鏡(×100)下分別測量每組細胞在0、24、48和72 h通過劃痕區的長度占劃痕區總長度的百分比代表其相對遷移率。6)Transwell小室試驗細胞三維空間遷移情況，遷移細胞用結晶紫染色，在倒置顯微鏡下分別計數5個視野，取其均值。7)細胞黏附實驗中0.02%結晶紫染色，酶聯免疫儀上測定各孔570 nm A值。黏附率(%)=［(實驗組細胞A值/BSA組細胞A值)－1］×100%。上述實驗中每組3個復孔，實驗重復3次。

表1 shRNA真核表達質粒的序列Table 1 Sequences of shRNA

1.3 統計學分析

用SPSS14.0統計學軟件進行數據分析，均數±標準差以(±s)表示，進行方差齊性檢驗與方差分析。配對計量資料采用配對t檢驗。率的比較用χ2檢驗。

2 結果

2.1 沉默VEGF后A431細胞中VEGF mRNA和蛋白的表達

轉染VEGF-s1，VEGF-s2的細胞中VEGF mRNA和蛋白表達量較N組顯著減少(P＜0.05)，VEGF-s1與VEGF-s2組間以及轉染T-off組與N組間均無差異(圖1)。

2.2 沉默VEGF對A431細胞增殖的影響

2.2.1 CCK-8法檢測轉染各組A431細胞的增殖:轉染后 24、48、72 和96 h，VEGF-S1，VEGF-S2 兩組與N組相比細胞增殖能力顯著下降(P＜0.05)。轉染VEGF-S1，VEGF-S2兩組間以及轉染T-off組與N組間均無差異(圖2)。

2.2.2 流式細胞儀檢測結果:與N組相比，轉染VEGF-s1和VEGF-s2組細胞阻滯于G1期，S期細胞數顯著減少，細胞增殖指數明顯減小(P＜0.001);轉染VEGF-s1和VEGF-s2組間以及轉染T-off組與 N組組間均無差異。轉染 VEGF-s1，VEGF-s2的細胞出現有意義凋亡峰(12%和11.28%)顯著高于轉染 T-off組(0.91%)(P＜0.05)，N組未出現凋亡峰(圖3)。

2.3 沉默VEGF對A431細胞遷移的影響

2.3.1 劃痕實驗:顯示轉染VEGF-s1和VEGF-s2兩組相對遷移率明顯比N組小(均P＜0.05)，其他時間點各組間均無顯著差異(圖4)。

2.3.2 Transwell小室檢測結果:顯示轉染VEGF-s1和VEGF-s2兩組細胞穿膜數(111±29和103±16)明顯少于N組(332±10)(P＜0.05)，而VEGF-s1與VEGF-s2組間以及N組與轉染T-off組(290±12)組間均無顯著差異(圖5)。

2.4 沉默VEGF對A431細胞黏附的影響

細胞黏附的結果:顯示轉染VEGF-s1和VEGF-s2兩組細胞黏附率(15.06%±0.28%和16.70%±0.65%)明顯比 N組(39.60% ±0.92%)低(P＜0.01)。VEGF-s1與 VEGF-s2組間及 N組與 T-off組(36.02% ±5.02%)間均無顯著差別(圖6)。

3 討論

本研究通過RNAi技術抑制皮膚鱗癌A431細胞中VEGF表達，研究VEGF對癌細胞增殖、遷移和黏附的作用。研究結果顯示，本研究設計與構建的靶向VEGF的shRNA(VEGF-s1，VEGF-s2)質粒轉染A431細胞后能顯著抑制細胞內VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達。通過靶向VEGF的RNAi技術處理A431細胞后細胞增殖能力明顯下降，發生G1期細胞周期阻滯，并使細胞調亡增加，進一步抑制了細胞遷移和黏附。該結果提示，VEGF與A431細胞增生、凋亡、遷移、黏附存在著密切關系。研究結果證明，本文構建的靶向VEGF的RNAi質粒具有較好的靶向性和高效性，為今后進一步在皮膚鱗癌中靶向VEGF的抑癌研究提供了基礎。

［1］Wang S，Liu H ，Ren L，et al.Inhibiting colorectal carcinoma growth and metastasia by blocking the expression of VEGF using RNA interference ［J］.Neoplasia，2008，10:399－407.

［2］Takei Y，Kadomatsu K，Yuzawa Y，et al.A small interfering RNA targeting vasculator endothelial growth factor as cancer therapeutics［J］.Cancer Res，2004，64:3365 －3370.

［3］荊春霞，張洹.VEGF siRNA的篩選、評價及siRNA的設計規則探討［J］.基礎醫學與臨床，2006，126:579 －585.