葡萄籽原花青素減輕小鼠急性化學性肝損傷

鄒金發，劉曉光，齊鳳杰，葉麗平

(遼寧醫學院1.病理生理學教研室;2.病理教研室;3.病理生理學教研室，遼寧錦州121001;4.遼寧省錦州市95905部隊衛生隊，遼寧錦州 121001)

肝性疾病目前呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類的健康。到目前為止，還無法徹底治愈大多數肝病。近年來有研究發現葡萄籽所含的有效成分原花青素(procyanidin)具有抗氧化和清除氧自由基的能力［1－2］。國內外研究證實葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)可抑制血脂，保護缺血心肌，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，對腫瘤細胞等也有不同程度的抑制作用［3－5］。但 GSP對實驗性化學性肝損傷的保護作用在國內外研究不多。本實驗通過復制小白鼠CCl4和酒精性肝損傷模型，探討GSP對小鼠化學性肝損傷的影響，為保肝護肝藥物的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

動物:清潔級，雄性昆明小鼠140只，體質量18～22 g，由遼寧醫學院動物實驗中心提供 (合格證號:［SYXK(遼)2003-0011)］。飼養環境溫度22±2℃，濕度控制在50% ～75%。

主要試劑:葡萄籽原花青素(西安天豐生物科技有限公司)，SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗分組及復制急性肝損傷模型

1.2.1 CCl4肝損傷模型:70只小鼠隨機分為7組，每組10只，分別設對照組、CCl4肝損傷模型組、5個GSP劑量組。對照組和模型組每天灌胃相同劑量0.9%氯化鈉注射液，GSP組按劑量灌胃(10、20、50、100和150 mg/kg)。7 d后除對照組外，其余各組腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液(10 mL/kg)，17 h后檢測。

1.2.2 酒精性肝損傷模型:70只小鼠隨機分為7組，每組10只，分別設對照組、酒精性肝損傷模型組、5個GSP劑量組。對照組和模型組每天灌胃相同劑量0.9%氯化鈉注射液，GSP劑量組處理同1.2.1。2 h后除對照組外，其他各組灌胃40%乙醇溶液 (12 mL/kg)，連續30 d。末次灌胃后禁食12 h檢測。

1.3 SOD、MDA含量檢測

取肝臟用冷0.9%氯化鈉注射液制成10%肝組織勻漿，根據試劑盒說明檢測肝組織勻漿過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.4 ALT AST含量檢測

小鼠斷頭取血分離血清，全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase，AST)含量。

1.5 HE染色觀察肝臟組織形態學改變

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 GSP對CCl4肝損傷性小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影響

成功復制小鼠CCl4肝損傷模型。與對照組比較，模型組 SOD活性顯著降低，MDA、ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。GSP干預組呈劑量依賴性顯著緩解或減輕上述變化(P＜0.010)(表1，2)。

表1 GSP對CCl4肝損傷性小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表1 GSP對CCl4肝損傷性小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±41 16.7±3.1 model 265±25* 74.3±5.1*GSP(10 mg/kg) 301±25# 53.5±4.0##GSP(20 mg/kg) 374±11## 50.4±0.5##GSP(50 mg/kg) 407±11## 41.7±4.0##GSP(100 mg/kg) 580±16## 34.9±2.9##GSP(150 mg/kg) 628±36## 33.6±3.3##

2.2 GSP對酒精性肝損傷小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影響

成功復制小鼠酒精性肝損傷模型。與對照組比較，模型組 SOD含量顯著降低，MDA、ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)。GSP干預組呈劑量依賴性顯著緩解或減輕上述變化(P＜0.01)(表3，4)。

表2 GSP對CCl4肝損傷性小鼠血清中ALT和AST含量的影響Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表2 GSP對CCl4肝損傷性小鼠血清中ALT和AST含量的影響Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 4 009±140* 4 737±139*GSP(10 mg/kg) 2 573±75# 3 625±127#GSP(20 mg/kg) 2 082±92# 3 315±68#GSP(50 mg/kg) 9 801±28# 2 623±103#GSP(100 mg/kg) 341±16# 1 166±97#GSP(150 mg/kg) 318±6# 665±16#

表3 GSP對酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表3 GSP對酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD活性及MDA含量的影響Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±42 16.7±31 model 225±19* 61.4±4.6*GSP(10 mg/kg) 277±14# 56.1±2.1#GSP(20 mg/kg) 295±15## 50.5±0.9##GSP(50 mg/kg) 344±12## 41.7±2.7##GSP(100 mg/kg) 406±15## 32.4±4.9##GSP(150 mg/kg) 469±16## 25.0±1.5##

表4 GSP對酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中ALT和AST含量的影響Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表4 GSP對酒精性肝損傷小鼠肝勻漿中ALT和AST含量的影響Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 272±21* 590±22*GSP(10 mg/kg) 267±24 389±10#GSP(20 mg/kg) 217±40# 335±14#GSP(50 mg/kg) 154±8# 271±17#GSP(100 mg/kg) 116±8# 220±7#GSP(150 mg/kg) 83±8# 190±27#

2.3 肝臟組織的形態學改變

鏡下可見對照組小鼠肝細胞形態正常，肝小葉規則，中央靜脈周圍肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞間及匯管區周圍無炎性反應細胞浸潤。CCl4肝損傷模型組肝細胞腫脹，胞質疏松化，可見明顯的水樣變性、點灶狀壞死及橋接壞死，匯管區伴大量炎性反應細胞浸潤。酒精性肝損傷模型組小葉中央區部分肝細胞發生水樣變性及脂肪變性，并見少量點灶狀壞死，匯管區伴大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，GSP組肝臟組織變性及壞死程度均減輕(圖1)。

3 討論

目前，對于傳染性病毒性肝炎是可以通過接種疫苗進行預防，而酒精性及藥物性肝損傷只能通過保肝護肝食品或者保健品來滋養防范。因此，研究者在不斷地尋找天然的、安全的及有效的且物美價廉的保肝護肝產品。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提煉出來的，而葡萄籽是生產葡萄食品、榨汁和葡萄酒業的廢棄部分，既物美價廉又很容易得到，因此對于開發保肝護肝藥物有很好的前景。

圖1 肝臟組織的病理變化Fig 1 Pathological change in the hepatic tissue(×400)

本研究采用兩種小白鼠肝臟損傷模型來探討GSP的保肝護肝作用。CCl4是經典的化學性肝損傷動物模型的毒劑，CCl4致毒機制為經肝微粒體細胞色素P450代謝生成自由基·CCl3攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質過氧化，自由基·CCl3繼而與膜脂質和蛋白質大分子進行共價結合，引起膜結構和功能完整性的破壞［6］。而機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧酸循環障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，乙醇可使α-磷酸甘油增多而促進三酰甘油合成，致使脂肪在肝細胞內沉積，同時乙醇能激活氧分子產生氧自由基導致肝細胞膜的脂質過氧化及體內還原型谷胱甘肽的耗竭，同時研究證實，酒精中毒可以直接引起肝臟纖維化，并直接進入肝硬化［7］。這兩種肝損傷模型均可造成實驗動物血清ALT、AST的升高和肝組織勻漿中SOD下降、MDA增加以及肝組織結構的病理改變，并且重復性好。故本實驗采用這兩種肝損傷動物模型。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的穩定代謝產物，其含量變化間接反映氧自由基含量的變化，從而反映細胞損傷的程度。SOD是一種帶負電荷的金屬酶，是體內重要的自由基清除劑，肝臟損傷后產生的大量自由基可以消耗SOD，使SOD水平下降，其含量變化可反映機體內源性抗氧化能力［8］。通過GSP對兩種小白鼠化學性肝損傷的保護作用研究可以看出，GSP在一定劑量下，對肝臟損傷有很強的保護作用。GSP是由兒茶素和表兒茶素為單位聚合而成的多酚類化合物，具有強大的抗氧化性和清除各種氧自由基的能力，主要是通過清除氧自由基和抑制脂質過氧化來完成的［9－10］，但是否還存在其他的保護肝臟的機制還有待進一步研究。

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