1株苯并[a]芘高效降解菌的分離鑒定

弓玉紅，郝 林，郭凱凱

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

苯并[a]芘（BaP）是一種含5個環的稠環芳烴，它是由1個苯環和1個芘分子結合而成的多環芳烴類化合物[1]。其分子式為C20H12，分子量為252。在室溫下，其為黃色或淡黃色晶體，熔點179℃，沸點496℃，相對密度為1.35，易溶于丙酮、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷乙醇、苯、甲苯、二甲苯、氯仿、乙醚等有機溶劑，極不易溶于水，這也是其在環境中難以被降解的原因之一[2]。苯并[a]芘大多是石油、煤炭等化石燃料以及木材、天然氣、汽油、重油、有機高分子化合物、紙張、作物秸稈、煙草等含碳氫化合物的物質經過不完全燃燒而生成。苯并[a]芘則是一種強致癌物[3]，其不僅存在于石油產品中，而且也存在于食品、大氣和煤焦油中[4]，也容易殘留在土壤中。許多國家都進行過土壤中BaP含量調查，殘留濃度取決于污染源的性質與距離[5]，公路兩旁的土壤中BaP含量為2.0 mg/kg，在煉油廠附近土壤中為200 mg/kg；被煤焦油、瀝青污染的土壤中，其含量高達650 mg/kg。農作物中的BaP殘留濃度取決于生產地附近是否有工業區或交通要道[6]。許多國家的動物試驗證明，苯并[a]芘具有致癌、致畸、致突變的特點。苯并[a]芘遇明火、高熱可燃，受高熱分解會釋放出有毒的氣體，即一氧化碳、二氧化碳、成分未知的黑色煙霧。

本研究在山西太谷縣焦化廠周邊耕地中采集被苯并[a]芘污染的土壤樣品，分離篩選到1株苯并[a]芘降解能力較強的細菌，經初步鑒定，屬于假單胞菌屬，為土壤苯并[a]芘污染的生物修復提供依據，以及為降解土壤苯并[a]芘污染微生物多樣性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

土樣采自山西省太谷縣焦化廠周邊耕地耕層土壤。富集用培養基[7]1 L：（NH4）2SO40.5 g，NaNO30.5 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，苯并[a]芘 5 mg（溶解于丙酮后加入），加水至1 L，pH值為7.5。2216E培養基1 L：蛋白胨5 g，酵母浸膏1 g，磷酸高鐵 0.01 g，pH值為7.6～7.8。

1.2 苯并[a]芘降解菌分離方法

稱取10 g土樣加入到含有適量玻璃珠的100 mL無菌水中，振蕩3 h[8-9]。靜置30 min后，移取5 mL上清液到45 mL含有苯并[a]芘質量濃度為5 mg/L的無機鹽培養基中，25℃，150 r/min搖床避光培養。每隔7 d移取10 mL菌液至滅菌的90 mL無機鹽-苯并[a]芘液體培養基中進行富集培養；連續富集培養28 d后，移取混合菌液稀釋，涂布于2216E固體平板培養基上分離、純化，觀察單菌落形態，并采用試管斜面保存菌株[10]，觀察菌株并進行形態特征和生理生化特征鑒定。

1.3 降解菌的鑒定

1.3.1 分離菌株生理生化特征的檢測 生理生化特征檢測參照文獻[11]進行。

1.3.2 16 S rDNA測序的PCR擴增及系統發育樹的構建 菌株總DNA的提取：采用CTAB法提取細菌的DNA于TE緩沖液中，-20℃保存備用。PCR反應：采用細菌的16 SrRNA通用引物，以提取的總DNA為模板，對該菌株的16 S rRNA進行PCR擴增。反應體系為：模板DNA 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物和下游引物（20 μmol/L）各 1 μL，加無菌水至50μL。反應程序：95℃5min；94℃1min，53℃1 min，72℃ 1.5 min，30個循環；72℃延伸10 min。然后對PCR擴增產物進行純化，純化產物送上海生工公司測序。所得測序結果在NCBI中進行序列搜索比對后，選擇親緣關系較近的幾種菌株作為參比菌株，用MEGA軟件構建系統發育樹。

1.3.3 苯并[a]芘含量的測定 在無機鹽液體培養基中加入丙酮-苯并[a]芘母液，使苯并[a]芘的質量濃度達到5 mg/L。振蕩培養10 d，同時設不接菌對照，每個處理重復3次。苯并[a]芘含量采用萃取-紫外分光光度法[11]測定。培養后向試管中加入環己烷重復萃取2次，合并萃取液在50mL容量瓶，定容，用紫外分光光度計在296 nm波長處測定其吸光度[1]，在標準曲線上對應查出樣品中剩余的苯并[a]芘含量。

1.3.4 苯并[a]芘降解率的計算 利用標準曲線計算樣品中剩余苯并芘的含量，然后利用公式c＝（a-b）/a×100%計算降解率。

其中，c為降解率；a為空白樣品中苯并[a]芘的含量；b為處理后剩余苯并[a]芘的含量。

2 結果與分析

2.1 苯并[a]芘降解菌的篩選與鑒定

以苯并[a]芘為唯一碳源篩選出1株高效降解菌，該菌株命名為A12，為球狀，革蘭氏染色呈陰性，極生鞭毛。根據文獻[10]，對A12生理生化測定結果如表1，表2所示。其系統發育關系如圖1所示。

表1 菌株形態鑒定結果

表2 菌株生理生化鑒定結果

菌株A12的16 S rRNA經測序后（NCBI序列號為AM184213.1），通過序列搜索和序列比對，發現菌株A12與Comamonas sp.DUT_AHX（DQ409079）的同源性最高，同源率為99.93%，Comamonas sp.DUT_AHX是1株睪丸酮叢毛單胞菌，對硝基苯有降解作用。與Pseudo-monas testosteroni屬的其他菌株（M11224和AB127967）同源率均高于99%以上，而這些菌株對芳香族化合物均有降解作用。基于上述形態鑒定、生理生化鑒定和16 S rRNA序列分析結果，初步確定A12菌株為睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）。

2.2 苯并[a]芘降解率

苯并[a]芘降解標準曲線如圖2所示。從圖2可以看出，苯并[a]芘質量濃度在1.0～3.0 mg/L的范圍內呈良好線性關系。對樣品的吸光度值進行測定，得出其吸光度值為0.069，對照為0.135。用標準曲線y＝0.424 8x－0.101 6計算得出，空白樣品中苯并[a]芘的含量（a）為0.557，處理后剩余苯并[a]芘的含量（b）為0.402。利用公式c＝（a－b）/a×100%計算降解率（c）為28%。綜合得出，菌株A12在苯并[a]芘質量濃度為5 mg/L、轉速為150 r/min、溫度為28℃的條件下，振蕩培養12 d，苯并[a]芘的降解率為28%。

3 結論

以苯并[a]芘為唯一碳源從焦化廠周邊耕地耕層土壤中篩選出1株降解菌A12，經鑒定為睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）；菌株A12在苯并[a]芘質量濃度5 mg/L、轉速150 r/min、溫度28℃的條件下，振蕩培養12 d時，苯并[a]芘的降解率為28%。

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