苯磺隆降解菌生長條件研究

王惟帥，吳濟南，張天寶，杜慧玲

（山西農業大學文理學院，山西太谷030801）

苯磺隆（Tribenuron-methly）是一種內吸傳導型磺酰脲類除草劑，于20世紀80年代由美國杜邦公司開發，具有高效、廣譜、低殘留、用量少等優點，是目前廣泛用于麥田雜草防治的除草劑之一。苯磺隆曾被認為是一種易降解且在生態環境中無殘留的農藥[1-2]。然而，后來有研究發現，由于其對光、熱穩定以及長期大量使用，給環境造成了土壤—水體—生物—大氣各層面直接、復合交叉和循環式的立體污染，對農業生產和生態平衡造成不利影響[3]。利用微生物代謝多樣性的特點對受污染土壤進行生物修復，是解決農藥污染的重要途徑[4-6]。目前，國內外關于苯磺隆的研究主要集中在藥效、殘留分析方法及其對植物生理特性的影響等方面[7-10]。而苯磺隆的生物降解以及苯磺隆降解菌生物學特性的研究鮮見報道[11-13]。山西農業大學農藥學實驗室從長期使用苯磺隆的污染土壤中，分離得到1株苯磺隆降解菌株，命名為BHL。本試驗以其為研究對象，進行生長條件特性的研究，旨在為苯磺隆降解菌的實際應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養基 無機鹽培養基（MM）組成為 ：MgSO4·7H2O 0.2 g/L；FeCl30.05 g/L；K2HPO41.0g/L；KH2PO41.0g/L；NaCl0.5g/L；CaCl20.02 g/L；NH4NO31.0 g/L；pH 值 7.0～7.5。

1.1.2 供試菌株和農藥 苯磺隆降解菌株BHL由山西農業大學農藥學實驗室分離獲得，苯磺隆原藥（純度95%）由中國沈陽化工研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株生長量測定 降解菌株經無菌水洗滌2次后，接種于無機鹽培養基（pH值7.0）中，使菌濃度達106個/mL，30℃，150 r/min振蕩培養。定時取樣，于OD600測定降解菌株BHL的生長情況。3次重復。

1.2.2 培養基初始pH值和Mg2+質量濃度對菌株BHL生長的影響 分別以初始pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 和 Mg2+質量濃度 100，200，300，400，500 mg/L為試驗組，將含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養基 （菌濃度大約達106個/mL）盛于250 mL三角瓶中，接種經活化24 h、磷酸緩沖液洗滌3次的降解菌株BHL后，30℃，150 r/min搖床振蕩培養，同1.2.1定時測定菌體的生長量。每個試驗設3次重復，并設置無菌為對照。

1.2.3 苯磺隆質量濃度和溫度對菌株BHL生長的影響 活化24 h的降解菌株BHL經磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于初始pH值為7.0，苯磺隆質量濃度分別為 50，100，200，300，400，500 mg/L的無機鹽培養基中（菌濃度大約達106個/mL），30℃，150 r/min搖床振蕩培養。測溫度的試驗組則將接種好菌株的含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養基置于 10，20，30，40，50 ℃的條件下培養，同1.2.1定時測定菌體的生長量。每個試驗設3次重復，同時設置無菌為對照。

1.2.4 通氣量對菌株BHL生長的影響 采用250 mL三角瓶分別盛有含苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養基 20，30，50，70，90 mL，將活化 24 h 的降解菌株BHL經磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于其中，于30℃，150 r/min搖床中振蕩培養，定時測定菌體生長量，每個試驗設3次重復，并設置無菌為對照。菌體生長量測定同1.2.1。

1.2.5 不同氮源、碳源對菌株BHL生長的影響

活化24 h的降解菌株BHL經磷酸緩沖液洗滌3次后，分別接種于以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆等為唯一氮源和以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基中，且所選的氮源、碳源質量濃度均為100 mg/L（菌濃度大約達106個/mL），30℃，150 r/min搖床中振蕩培養，定時測定菌體生長量，每試驗3次重復，并設置無菌為對照。菌體生長量測定同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 培養基初始pH值對降解菌株BHL生長的影響

從圖1可以看出，在含有苯磺隆100 mg/L的無機鹽培養基中，pH值在6.5～9.0范圍內，菌株BHL均可以生長。不同時間的OD600值隨著培養基初始pH的增加表現出先增加后減少的趨勢；當pH值為7.0時，OD600最大，說明菌株在pH值為7.0時，生長最佳。

2.2 苯磺隆質量濃度對降解菌株BHL生長的影響

由圖2可知，降解菌株BHL在苯磺隆質量濃度為50～500 mg/L時均可以生長。除50 mg/L外，其他質量濃度處理均在第7天時OD600值達最大；當苯磺隆濃度為100 mg/L時，不同時間的OD600值均為最大，說明菌株在苯磺隆質量濃度為100 mg/L時，生長最好。

2.3 溫度對降解菌株BHL生長的影響

從圖3可以看出，降解菌在所設的溫度條件下均可以生長。隨著溫度的升高，OD600呈先增加后減少的變化趨勢；當溫度為30℃時，菌株長勢最好。

2.4 通氣量對降解菌株BHL生長的影響

由圖4可知，在250 mL的三角瓶中裝入20～90 mL培養液后，菌株BHL均可以生長，但隨著培養基體積的增加，不同時間OD600呈先增加后減少的變化趨勢。當裝液量為50 mL（1/5體積）時，降解菌株BHL的生長最好。

2.5 Mg2+質量濃度對菌株BHL生長的影響

從圖5可以看出，降解菌株BHL在供試Mg2+質量濃度范圍內均可以生長。當Mg2+質量濃度為200 mg/L時，生長最佳。

2.6 不同氮源對降解菌株BHL生長的影響

由圖6可知，降解菌株BHL在以尿素、酵母膏、硝酸鈉和苯磺隆分別為唯一氮源的培養基中均可以生長，生長情況視不同氮源而異（酵母膏＞尿素＞苯磺隆＞硝酸鈉）。從圖6可以看出，以酵母膏為氮源時，降解菌株BHL的生長最好，OD600值明顯高于其他幾種氮源。苯磺隆作為唯一氮源時，菌株BHL可以生長，與以尿素、硝酸鈉為氮源時生長狀況差異不大。

2.7 不同碳源對菌株BHL生長的影響

從圖7可以看出，以相同質量濃度的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆分別為唯一碳源的培養基中，以葡萄糖為碳源時，降解菌株生長情況較其他碳源要好。在所選碳源的培養基中，降解菌株雖都能生長，但生長情況較差，OD600值都在0.1以下。

3 討論與結論

土壤中農藥的降解途徑，一般分為物理、化學與生物過程，而微生物降解與化學水解是其主要降解途徑。土壤環境中存在多種可以降解農藥的微生物。近年來，國內外研究者開展了生物強化修復農藥的研究，通過富集培養、分離篩選等技術已經篩選出很多能夠降解農藥的微生物，應用微生物進行生物修復已成為環境修復的一個主要研究方向。生物修復技術主要是利用微生物的降解作用，將污染物分解并最終去除，它具有無毒、無殘留、無2次污染等優點。而在修復過程中，外源降解菌的穩定性、活性等因素是影響生物修復的關鍵因素。因此，當引入外源降解菌對土壤進行生物修復時，只有了解降解菌的生物學特性，才能通過人為調控的手段來促進、強化生物修復，為提高農藥的生物降解效率提供技術依據。有關磺酰脲類除草劑降解菌生長特性等方面的研究報道相對較少[14-15]。

本試驗對從長期使用苯磺隆的田間土壤中分離得到的苯磺隆降解菌株生長條件優化研究表明，苯磺隆降解菌株BHL在pH值為6.5～9.0的范圍內均可以生長，但以pH值為7.0時生長最佳；苯磺隆質量濃度對菌株BHL的生長有一定的影響，其質量濃度為100 mg/L時，菌株BHL生長最好；10～50℃范圍內降解菌可以生長，但30℃時生長最好；250 mL三角瓶，裝液量為20～90 mL菌株BHL均可以生長，但裝液量為50 mL時菌株生長狀況最好；Mg2+質量濃度為100～500 mg/L的范圍內，菌株均可以生長，但當Mg2+質量濃度為200 mg/L時，菌株BHL的生長最佳。以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆為唯一氮源和以100 mg/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基中，菌株BHL均可以生長，其中，分別以酵母膏為碳源和以葡萄糖為氮源時，生長最好；且以苯磺隆為唯一氮源或碳源菌株都能夠正常生長。

苯磺隆降解菌生長特性的研究，為利用生物手段修復苯磺隆污染土壤的研究提供了理論基礎，同時為生產實踐中的應用提供了技術支撐。

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