卵清蛋白誘導小鼠建立支氣管哮喘模型

張亞娟，王亞楠，丁亞駿，何璐云，劉 鑫，康巧珍

(鄭州大學生物工程系 河南鄭州 450001)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡稱哮喘)是一種慢性反復發作的、由多種細胞(尤其是肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T細胞)和細胞因子參與的氣道變態反應性疾病［1］，在抗原刺激時會引起支氣管平滑肌收縮、腺體分泌增多和黏膜血管擴張，最終導致支氣管管腔狹窄、呼吸困難，嚴重時導致死亡。目前哮喘的發病率和死亡率逐年增長，尚無根治的辦法，嚴重困擾著人類的健康。關于哮喘發病機制的探索、哮喘新藥的研究與開發、新治療方法的評價都主要依賴于動物實驗［2］。目前國外大多數選用BALB/c小鼠來構建哮喘模型，但由于國內外不同的實驗條件，國外文獻提及的哮喘模型建立方法在國內并不完全適用［3］。本實驗結合了國內外文獻的報道，通過控制實驗動物條件、致敏方法等，建立了1個穩定的小鼠哮喘模型，以便于支氣管哮喘的研究及治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4～6周齡，健康的雌性BALB/c小鼠16只(鄭州大學動物實驗中心提供)，隨機分為兩組，A組8只，為對照組，以生理鹽水代替OVA(Grade V Sigma公司)致敏和激發;B組8只，為模型組，用OVA致敏和激發。

1.2 主要試劑與儀器 卵清蛋白OVA，氫氧化鋁(Sigma公司)，402AI超聲霧化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立

1.3.1 動物致敏:B組小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射新配置的致敏液0.2 ml(每0.2 ml致敏液中含有OVA粉末10 μg，氫氧化鋁粉末20 mg)致敏;A組小鼠用生理鹽水代替致敏液，注射部位及劑量相同［4］。

1.3.2 動物激發:用生理鹽水配制濃度為1% 的OVA溶液，即得霧化液。于第28～30天，將B組小鼠置于5 L自制密閉容器中，以霧化液霧化吸入激發(402AI型超聲霧化器提供霧化動力)，使小鼠暴露在OVA氣霧中，每天30 min;A組小鼠在相同條件下以生理鹽水代替霧化液霧化吸入激發，實驗中尤其要注意觀察霧化過程中模型組小鼠出現的陽性反應:腹肌抽搐、呼吸急促、大小便失禁等［5］。

1.4 肺泡灌洗液收取及細胞分類計數 在最后1次霧化24 h后脫臼處死小鼠，消毒分離出氣管，剪開氣管，把2 ml注射器針頭插入氣管內并固定。每次注入生理鹽水 0.8 ml，回抽，共2次(回抽率達 85%以上)［4］。將 BALF 于 1 200 r/min，4 ℃ 離心 10 min，離心兩次，沉渣重懸后涂片行瑞氏－姬姆薩復合染色，然后進行白細胞分類計數。

1.5 肺組織病理切片的染色 在兩組小鼠肺泡灌洗后取肺，并用生理鹽水8～10 ml沖洗，福爾馬林固定，進行HE染色。

2 結果

2.1 小鼠行為學觀察 A組小鼠無癥狀;B組小鼠出現煩躁不安，弓背抓臉，呼吸急促，前肢縮抬，腹肌抽搐，大小便失禁，最后安靜少動等癥狀。

2.2 BALF白細胞分類計數 BALF中白細胞總數和EOS計數見表1。A組小鼠BALF中EOS%(2.12 ±0.58)，B 組小鼠 BALF 中 EOS%(17.20 ± 4.19)，兩組比較差異有統計學意義(t=9.52，P ＜0.001)。

表1 BALF中細胞總數和EOS計數

2.3 小鼠肺組織病理改變 肉眼可見模型組小鼠肺臟體積比對照組明顯增大;肺臟表面腫脹，有暗紅色充血區域，且充血區域形狀不規則;組織切面有白色泡沫狀的物質滲出。將肺組織切片行HE染色后，光鏡下可看到支氣管和其伴行血管周圍有較多的炎癥細胞浸潤，氣道上皮有多處斷裂，基底膜增厚明顯且形態不規則［6］。見圖 1。

圖1 小鼠肺組織切片的光鏡觀察(HE染色，×100)

3 討論

支氣管哮喘是一種嚴重的呼吸道過敏反應性疾病，也是常見的威脅人類健康的慢性呼吸道疾病。目前全球支氣管哮喘患者人數高達3億多，且哮喘的發病率一直在上升，近10年來我國哮喘兒童人數上升了60%，引起了世界各國科研工作者的重視。因此，建立一種可靠的哮喘模型對研究哮喘的發病機制及治療十分重要。

目前國內外報道的哮喘模型種類繁多，雖不能完全模擬人類哮喘的病理生理過程，但都產生了支氣管哮喘的典型癥狀，如支氣管上皮損傷、黏液過度分泌、肺內EOS% 增多、肺組織切片可見大量炎癥細胞浸潤等。本實驗中，模型組小鼠在霧化激發期間出現了比較明顯的哮喘急性發作癥狀;模型組BLAF中EOS%較對照組明顯增加;病理表現具體為:肺組織水腫、腺體分泌增多、基底膜增厚、氣管變形、氣道上皮脫落、肺組織切片HE染色后可見大量炎癥細胞浸潤、尤其是嗜酸性粒細胞增多等表現［3］，符合哮喘的病理學特征。

以上結果表明，此模型能夠用于哮喘的實驗研究，此實驗模型的構建對支氣管哮喘的研究和治療具有重要意義。然而對于此模型中存有的一些缺點和不足，需要在我們以后的研究和工作中不斷地認識、改進和完善。

［1］原樹云.哮喘患兒血清IL-10、IL-4與IgE水平的檢測及意義［J］.河南醫學研究，2009，18(1):16-18.

［2］Michelle M.Epstein.Are mouse models of allergic asthma useful for testing novel therapeutics［J］.Experimental and Toxicologic Pathology，2006，57(2):41-44.

［3］田代印，符舟，張燕，等.一種改良型小鼠哮喘模型方法的建立及評價［J］.重慶醫科大學學報，2005，30(4):601-603.

［4］李美容，王敏.哮喘小鼠模型的建立與評價［J］.臨床肺科雜志，2011，16(5):664-665.

［5］王妍，金先嬌.支氣管哮喘實驗模型的研究進展［J］.國際呼吸雜志，2006，26(1):70-72.

［6］程曉明，王長征，李淑平，等.哮喘致敏小鼠模型的建立及脾臟CD4+T細胞的分離［J］.第三軍醫大學學報，2001，23(3):369-370.