親和層析純化重組中性粒細胞激活蛋白

丁亞駿，何璐云，王亞楠，張亞娟，康巧珍

(鄭州大學生物工程系 河南鄭州 450001)

中性白細胞和單核細胞的浸潤往往會伴隨著幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)在人的胃黏膜定植而產生，中性白細胞浸潤與胃黏膜損傷程度有一定的相關性。在H.pylori的水抽提物中含有一種能趨化并激活白細胞的成分，稱為中性白細胞激活蛋白(neutrophil-activating protein，NAP)［1-4］。幾乎在所有 H.pylori菌株中都含有編碼HP-NAP的基因HP-napA，Satin等［5］提出NAP是H.pylori的主要毒力因子并且可以作為疫苗研究中的免疫保護性候選抗原。目前HP-NAP在H.pylori免疫反應中的作用正在逐步的研究與探索之中。但從H.pylori菌株中直接大規模純化這一組分存在一定難度。隨著研究深入傳統的純化方法無法滿足科研需求。如今科研工作者從與大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)融合表達 HP-NAP工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)中快速高效分離純化重組融合蛋白。然而以往對rMBP-NAP的分離純化大多采用FPLC分子排阻層析法，該方法廉價，但伴隨的是提取蛋白濃度、純度有限，且耗時較長、消耗精力較大，無法滿足后期實驗對該蛋白的質與量上的需求。本實驗采用直鏈淀粉樹脂親和層析法對rMBP-NAP進行分離純化，快速分離純化出高濃度、高純度的融合蛋白rMBP-NAP，為HP-NAP的疫苗研究等后續實驗提供材料。

1 材料與方法

1.1 工程菌及主要試劑 基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA);直鏈淀粉樹脂層析柱。

1.2 rMBP-NAP的誘導表達 挑取工程菌單菌落接種于氨芐青霉素培養液中，37℃ 200 r/min過夜培養，取菌液接種于豐富培養基中(含氨芐)，37℃ 230 r/min振蕩培養至對數生長期，加入誘導劑IPTG至終度濃度0.3 mmol/L，繼續培養 3 h。取菌液 200 μL 離心，10%分離膠(SDS-PAGE)檢測誘導表達效果。

1.3 菌體的收獲及超聲破碎 IPTG誘導后的培養物分裝于離心管，4℃ 4 000 g離心20 min，棄上清，用5 ml過柱緩沖重懸沉淀，－20℃凍存過夜，室溫解凍，于冰水浴中300 W 短脈沖超聲破碎(超聲5 s，間隔15 s，重復20次左右)至菌液透明。4℃ 9 000 g離心30 min，轉移上清，分別取超聲上清和沉淀行 SDSPAGE，分析融合蛋白rMBP-NAP的可溶性。

1.4 SDS-PAGE 凝膠圖像分析儀照相。

1.5 親和層析分離純化rMBP-NAP

1.5.1 親和層析柱的制備:將直鏈淀粉樹脂灌入層析柱。以8倍柱子體積的過柱緩沖液(20 mmol Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)平衡柱子。

1.5.2 超聲上清過柱:超聲破碎并離心后所得的上清，用過柱緩沖液稀釋(1∶5)，以1 mL/min的速度使液體通過親和層析柱。

1.5.3 雜蛋白的去除:用12倍柱體積的過柱緩沖液沖洗親和層析柱。

1.5.4 洗脫rMBP-NAP:用含有濃度為10 mmol/L麥芽糖的過柱緩沖液洗滌柱子，用5 mL滅菌離心管收集洗脫液，每管3 mL，共收集20管。SDS-PAGE檢測每管洗脫液中的蛋白成分。

1.6 rMBP-NAP濃度測定 蛋白質定量試劑盒(普利萊基因技術有限公司)檢測蛋白濃度。

1.7 rMBP-NAP純度檢測 使用 ImageJ(version 1.44p)檢測融合蛋白純度。

2 結果

2.1 SDS-PAGE檢測IPTG誘導表達效果 rMBPNAP相對分子質量約57 kD與預期結果一致。IPTG成功誘導工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表達融合蛋白rMBP-NAP，見圖1。

圖1 IPTG誘導基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表達rMBP-NAP

2.2 SDS-PAGE檢測 rMBP-NAP融合蛋白可溶性 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)誘導表達的rMBPNAP主要以可溶性形式存在于超聲上清中，相對分子質量約為57 000，與預期結果一致，見圖2。

圖2 IPTG誘導基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)表達融合蛋白rMBP-NAP的可溶性檢測

2.3 SDS-PAGE檢測rMBP-NAP親和層析效果IPTG誘導的基因工程菌 E.coli TB1(pMAL-c2X-napA)超聲上清，用直鏈淀粉樹脂親和層析柱純化，洗脫液進行SDS-PAGE檢測，見圖3。

圖3 SDS-PAGE檢測重組蛋白rMBP-NAP直鏈淀粉樹脂親和層析效果

2.4 rMBP-NAP蛋白濃度測定 參照蛋白定量試劑盒說明書，酶標儀于570 nm波長測量吸光度值并繪制標準曲線。融合蛋白rMBP-NAP吸光度OD570=0.64，根據標準曲線得出蛋白濃度為625 μg/mL，見圖4。

圖4 蛋白質定量試劑盒檢測rMBP-NAP蛋白濃度

2.5 融合蛋白rMBP-NAP純度檢測 親和層析純化后的rMBP-NAP融合蛋白經SDS-PAGE檢測后，利用軟件ImageJ(version1.44p)根據SDS-PAGE照片繪圖計算蛋白純度。軟件計算得出rMBP-NAP純度為96.78% 。

3 討論

以往的實驗研究中，獲取rMBP-NAP采用的是快速蛋白液相層析色譜法(FPLC)，是運用快速蛋白純化全自動色譜系統來進行分離純化。該方法效率較為優越，靈敏度高(可達到10－9g/ml數量級)，洗脫過程梯度變化，洗脫效果好。但是，FPLC方法在實行的過程中，需要有專業的人士來操縱快速蛋白液相分析系統進行實驗，對實驗條件和實驗人員要求較高。本實驗應用直鏈淀粉樹脂，對IPTG誘導工程菌表達的重組蛋白rMBP-NAP直接進行親和層析，實現了一步純化。該方法操作簡便，實驗周期短，純化得到的rMBP-NAP具有較高濃度和純度，可滿足科研的需要。同時，與HP-NAP融合表達的麥芽糖結合蛋白(MBP)不僅可用于親合層析，還有商品化的MBP抗血清，可用于免疫反應跟蹤鑒定實驗結果。這對一種新的重組蛋白的鑒定尤為重要。

有報道，應用FPLC分子排阻層析法分離的rMBPNAP 的純度為 91% ，含量為 0.121 g/ml［8］。本實驗結果表明，直鏈淀粉樹脂親和層析法分離純化rMBPNAP無論是從效率上還是純度上都優于FPLC分子排阻層析法。因此，應用直鏈淀粉樹脂親和層析法可更快更好地分離純化融合蛋白rMBP-NAP，為HP-NAP的疫苗研究等后續實驗提供材料。

［1］周永寧，徐采樸.幽門螺桿菌中性白細胞激活蛋白的研究進展［J］.免疫學雜志，2001，17(3):53-55.

［2］康巧珍，段廣才，范清堂，等.幽門螺桿菌中性白細胞激活蛋白與麥芽糖結合蛋白融合表達產物rMBP－NAP的分離純化［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2004，39(5):746-749.

［3］Qiao-Zhen Kang，Guang-Cai Duan，Qing-Tang Fan，et al.Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli［J］.World J Gastroenterol，2005，11(3):454-456.

［4］Gaia Codolo，Paola Mazzi，Amedeo Amedei，et al.The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down－modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma［J］.Cellular Microbiology，2008，10(11)，2355-2363.

［5］Satin B，Del Giudice DG Della，Bianca DV，et al.The neutrophilactivating protein(HP-NAP)of Helicobacter pylori is a protective antigen and a major virulence factor［J］.J Exp Med，2000，191(9):1467-1476.