車前草總三萜對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用

楊亞軍， 李慶耀， 梁生林， 孫朝越， 劉 兵， 張 杰， 王 磊， 崔 燎

(1.井岡山大學醫學院，江西吉安343000;2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515;3.井岡山大學醫學院附屬醫院，江西吉安343000;4.廣東醫學院藥理學教研室，廣東湛江523808)

車前草為車前科(Plantaginaceae)植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，是《中國藥典》(2010年版)收載的常用中藥。車前草性寒，味甘，具有清熱解毒、利尿、祛痰、涼血之功效，用于水腫尿少、暑濕瀉痢、痰熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥［1］。據報道，車前草全草或其復方，在臨床上可用于治療慢性肝炎［2-3］，車前草粗提物對CC14致急性肝損傷有保護作用［4-5］。研究表明，車前草中含有熊果酸、齊墩果酸等三萜類化合物［6］，二者均為抗肝炎活性物質［7］，且后者已制成抗肝炎藥在臨床上廣泛應用。因此，本研究以自制車前草總三萜(TTP)為實驗材料，采用CC14誘導小鼠急性肝損傷模型，觀察TTP對急性肝損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 江西產車前草，購自亳州市遠光中藥飲片廠，批號20090901，經井岡山大學醫學院藥學教研室彭才圣教授鑒定為平車前Plantago depressa Willd.;TTP浸膏，自制，經測定其總三萜含有量可達53%;水飛薊賓膠囊，購自天津天士力制藥股份有限公司生產，批號100604;CCl4，分析純，南京化學試劑廠生產;丙氨酸氨基轉移酶(ALT，批號2010102)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號2010104)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，批號2010101)、丙二醛(MDA，批號2010104)與總蛋白(T-Protein，批號2010103)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質量為20～24 g，由江西中醫學院實驗動物中心提供，清潔級，實驗動物生產許可證號SCXK(贛)2005-0001，實驗動物使用許可證號JZDWNO.2010-0287。

1.3 儀器 FA1604N電子天平;spectrumlab 53紫外-可見分光光度計;電熱恒溫水浴鍋;低溫高速離心機;數顯恒溫水浴鍋HH-4。

2 方法

2.1 動物分組和造模方法 小鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、模型組、陽性藥水飛薊賓組、TTP高劑量組和TTP低劑量組，每組10只。各組試藥均用0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液，自造模前7 d起，每天按0.1 mL/10 g體積灌胃給藥1次，共7次，正常對照組給予等體積溶劑。末次給藥2 h后，小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.2 mL/kg，正常對照組腹腔注射等體積花生油，在造模期間禁食，可自由飲水。實驗期間，所有小鼠均食用標準條狀飼料，并觀察記錄其精神狀態、反應活動、毛發光澤、食欲排泄、體質量變化等情況。造模18 h，小鼠稱質量后，于眼眶后靜脈叢采血，室溫放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清液備用;小鼠處死后，取其肝臟，預冷生理鹽水沖洗，拭干，稱質量，取肝臟右葉同一部位經10%甲醛固定，用于病理學切片觀察;稱取定量組織，用冷生理鹽水制成10%的肝勻漿，于4℃3000 r/min離心15 min，取上清液備用。

2.2 生化指標測定方法 血清中AST和ALT的含有量，肝組織中T-Protein、T-SOD、MDA的量，均按照試劑盒說明書規范操作。

2.3 組織切片觀察 組織10%甲醛溶液固定24 h后，石蠟包埋后制成5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學變化。將肝組織損傷程度分為4級［8］:0級(-)，肝組織結構正常，無明顯變性，壞死及炎癥細胞浸潤;l級(+)，肝小葉結構尚正常，可見明顯的混濁腫脹，散在的脂肪變性和細胞點狀壞死，偶見炎癥細胞浸潤;2級(++)，肝小葉結構不清，可見局部區域性脂肪變性和細胞灶狀壞死，伴有較多炎癥細胞浸潤;3級(+++)，肝小葉結構不清、可見彌漫性變性、壞死，伴有明顯區域性炎癥細胞浸潤。

3 結果

3.1 一般情況 各組小鼠在造模前生長狀態良好，進食飲水正常，毛色光滑潤澤，糞便呈褐色顆粒狀;造模后，除正常對照組外，其余各組小鼠均不同程度表現為少動聚集，反應遲緩，容易激怒，難以捉拿，毛發蓬亂，毛色暗淡，大便稀軟，但各組均沒有出現死亡情況。

各組小鼠灌胃后未見明顯中毒癥狀，實驗前后各組小鼠體質量與正常對照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。小鼠腹腔注射CCl4后，肝臟系數值比正常對照組增大，但模型組與空白對照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。除陽性藥外，TTP高、低劑量組小鼠肝臟系數均較模型組小鼠顯著降低(P＜0.05)。結果見表1。肝臟系數為小鼠肝臟濕質量占處死前體質量的百分比。

3.2 TTP對致肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響 與正常對照組相比，造模后各組小鼠血清ALT和AST的活性均顯著性升高(P＜0.01)，說明急性肝損傷模型復制成功;與模型組相比，TTP能降低模型小鼠ALT與AST水平，且低劑量TTP對AST的影響具有顯著性差異(P＜0.01)，見表2。

3.3 TTP對致肝損傷小鼠血清T-SOD和MDA的影響 造模后，小鼠肝組織中蛋白量普遍增高，但是給藥小鼠蛋白量均下降，且與模型組小鼠蛋白量有顯著性差異。同時，模型組小鼠肝組織中T-SOD水平下降，脂質過氧化產物MDA量升高，TTP和水飛薊賓均能增強T-SOD活性，降低MDA量(P ＜0.01)，見表3。

表1 實驗前后各組小鼠體質量變化與肝臟系數(± s，n=10)

表1 實驗前后各組小鼠體質量變化與肝臟系數(± s，n=10)

注:與正常對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05。

/%正常對照組組別 劑量/(g·kg-1)初始體質量/g終末體質量/g肝臟系數- 23.7 ±0.8 27.3 ±2.0 4.84 ±0.26模型組 - 23.0 ±1.4 26.5 ±1.7 5.21 ±0.12＊＊陽性藥組 0.15 22.7 ±1.2 25.6 ±1.9 5.34 ±0.45*TTP 高劑量組 0.04 21.8 ±2.1 25.3 ±1.8 4.95 ±0.29#TTP 低劑量組 0.02 22.4 ±2.0 26.8 ±2.3 4.99 ±0.20#

表2 TTP對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響(± s，n=10)

表2 TTP對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響(± s，n=10)

注:與正常對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg-1)ALT/(IU·L-1) AST/(IU·L-1)正常對照組- 21.50 ±8.91 49.15 ±6.41模型組 - 154.75 ±12.74＊＊ 198.26 ±27.10＊＊陽性藥組 0.15 107.76 ±19.51＊＊#174.82 ±25.18＊＊#TTP 高劑量組 0.04 128.55 ±10.45＊＊ 168.05 ±32.49＊＊#TTP 低劑量組 0.02 110.20 ±16.56＊＊#156.35 ±28.70＊＊#

表3 TTP對CCl4致肝損傷小鼠組織中T-SOD和MDA的影響(± s，n=10)

表3 TTP對CCl4致肝損傷小鼠組織中T-SOD和MDA的影響(± s，n=10)

注:與正常對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量(g·kg-1) T-Protein/(g·L-1) T-SOD/(U·mgpro-1) MDA/(nmol·mgpro-1)正常對照組0.98 ±0.31 166.03 ±33.22 4.89 ±1.72模型組 - 1.11±0.06 96.62±17.72＊＊ 6.69±1.80*陽性藥組 0.15 1.03 ±0.05# 131.78 ±20.37*# 4.20 ±1.83#TTP 高劑量組 0.04 1.00 ±0.10# 142.98 ±26.81# 4.04 ±1.59#TTP 低劑量組 0.02 1.10 ±0.06# 153.26 ±42.37# 4.30 ±1.56-#

3.4 TTP對急性肝損傷小鼠肝臟病理形態學的影響

3.4.1 肉眼觀察 正常對照組小鼠肝臟組織呈鮮紅色，外表光滑亮澤，質地柔軟，富有彈性;模型組小鼠肝臟組織呈暗紅色，表面粗糙，附著肉眼可見的黃色顆粒，缺乏彈性，體積腫大，而給藥各組小鼠肝臟病變較模型為輕。

3.4.2 光鏡觀察 正常對照組小鼠基本無異常;模型組小鼠肝小葉中央區明顯灶狀壞死，細胞不圓整，結構不清晰，細胞核較小，出現水腫和氣球樣變，有大量脂肪變性，細胞間質有炎性細胞浸潤;給藥組和陽性藥組中肝組織炎性細胞浸潤減輕，肝細胞變性、壞死等病理性損傷均有不同程度的緩解，其中，TTP低劑量組最為明顯，見表4。

表4 TTP對CCl4致肝損傷小鼠肝組織病理損傷的影響(± s，n=10)

表4 TTP對CCl4致肝損傷小鼠肝組織病理損傷的影響(± s，n=10)

注:與正常對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg-1)肝細胞變性P 肝細胞壞死P 炎性浸潤P- + ++ +++- + ++ +++- + ++ +++- 10 0 0 0 10 0 0 0 9 1 0 0模型組 - 0 2 6 2 ＊＊ 0 2 5 3 ＊＊ 0 0 4 6 ＊＊陽性藥組 0.15 3 5 1 1 ＊＊# 3 4 2 1 ＊＊# 3 5 2 0 ＊＊#TTP高劑量組 0.04 2 4 3 1 ＊＊ 2 6 1 1 ＊＊ 3 6 1 1 ＊＊#TTP低劑量組 0.02 3 4 3 0 ＊＊# 4 4 2 0 ＊＊# 2 8 0 0 ＊＊#正常對照組

4 討論

CCl4是研究實驗性肝損傷模型常用的化學誘導劑，可造成模型動物脂質過氧化產物MDA大量生成，氧自由基清除劑SOD水平明顯下降，造成的肝炎模型在形態學與病理學方面與人類肝損傷極為相似，因此，該模型已成為篩選和研究治療肝炎類藥物的經典模型［10］。TTP可降低MDA量，提高肝組織中T-SOD活性，提示TTP可提高CCl4致急性肝損傷后小鼠的抗氧化能力，減輕肝細胞的變性壞死和炎性浸潤等病理變化，并能夠降低肝臟系數。至于TTP對肝損傷的保護作用是否還存在其它機制，尚須進一步深入研究。

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