加減溫經湯對寒凝血瘀模型大鼠子宮內膜ER、PR表達的影響

徐丁潔， 成秀梅， 杜惠蘭*， 徐 洪

(1.河北醫科大學中西醫結合婦科教研室，河北石家莊050091;2.河北醫科大學中西醫結合外科教研室，河北石家莊050091;3.河北醫科大學病理科，河北唐山063000)

寒證為八綱之一，婦科寒證是臨床較為多見的病證之一。我們曾對1122名婦女進行流行病學調查發現，屬月經病寒證者411人，占36.63%［1］。寒客沖任、胞宮，影響女性正常經孕。正常月經一方面依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸調節功能正常，促使卵泡發育成熟，分泌雌、孕激素。另一方面，雌、孕激素須與子宮內膜組織中的相應受體結合，才能發揮其生理作用［2］。本實驗通過研究加減溫經湯對寒凝血瘀模型大鼠卵巢激素雌二醇(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)水平及子宮內膜雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)表達的影響，探討其治療寒凝血瘀型婦科疾病的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，雌性，鼠齡3個月，體質量(190±10)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK(冀)2008-1-003，合格證號1006025。

1.2 試劑 加減溫經湯:當歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、肉桂10 g、莪術 10 g、丹皮 10 g、吳茱萸 10 g、懷牛膝 12 g、甘草6 g，一次性購于石家莊樂仁堂藥業。首先將當歸、川芎、莪術、肉桂、吳茱萸5種藥物浸泡，然后加入8倍量的水，用蒸餾法提取揮發油，密閉保存。取藥渣與浸泡的其他藥物一起水煎3次，30 min/次，過濾，共得藥液 1200 mL，離心、濃縮至含生藥3.52 g/mL。將藥液置4℃冰箱備用，用時取出，與揮發油混合，用蒸餾水稀釋至所用濃度。

E2(批號RG60905)、P(批號RG50905)放免試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司。

一抗:ERα(SC-542)、PR(SC-538)(兔抗大鼠)工作液購自Santa Cruz Biotechnology。二抗:SP－9001兔 SP kit，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。濃縮型DAB試劑盒，ZLI-9032，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 造模方法及分組 大鼠30只，適應性飼養1周后，隨機分為正常組、模型組、治療組，每組10只。正常組常規飼養，另兩組大鼠置于0～1℃冰水中20 min，1次/d，連續2周［3］。治療組于造模的第1天開始，每日分別按29.32 g/kg(相當于臨床成人劑量的20倍)給予加減溫經湯灌胃，連續2周。

1.4 陰道上皮細胞檢查 每日上午、下午各做陰道涂片一次，處死前2 d，每隔2 h涂片一次以確定動情周期，以0.5%的堿性美藍溶液染色10 min，自來水輕輕洗去多余的染色液，待干，用普通光學顯微鏡觀察。

1.5 取材方法 擇動情期間斷頭取血，制備血清，放射免疫分析法檢測E2、P。取子宮，吸去血跡，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，進行免疫組織化學染色，觀察子宮內膜ER、PR的表達。

1.6 免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟到水。滴加0.1%的胰酶，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。3%H202去離子水室溫孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，37℃烤箱中孵育10 min，傾去，勿洗。滴加1∶200稀釋的一抗，4℃過夜。PBS沖洗，3 min×3次。滴加生物素標記的二抗IgG，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗，3 min×3次。室溫下DAB顯色2～5 min。自來水終止顯色，蘇木復染，返藍，脫水，透明，封片。

切片均在同一條件下按SP法進行免疫組化染色。用已知的陽性切片同時在同一條件下染色作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.7 圖像分析及統計學處理 每個組織隨機選取1張切片進行分析，應用Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件進行圖像采集和分析。于每張切片隨機選取6個視野，各采集1張200倍的圖像，計算積分光密度(integral optical density，IOD)值，6張圖像的IOD平均值作為該片指標的代表值。平均光度值越高，表達越強。

2 結果

2.1 動物一般狀況 實驗過程中，正常組和治療組大鼠外觀無明顯差異，毛色白而光澤，精神狀況佳，活潑，反應靈敏;模型組大鼠精神不振，毛色不榮，尾涼，少動、大部分出現腹瀉。

2.2 動情周期的變化 根據陰道上皮脫落細胞［4］判斷大鼠動情周期，分為動情前期、動情后期和動情間期。比較各組大鼠處死前最后一個動情周期各階段時間的變化。

與正常組比較，模型組大鼠動情周期及動情間期延長，差異有統計學意義(均P＜0.05)，與模型組比較，治療組大鼠動情周期及動情間期縮短，差異有統計學意義(均P＜0.05)，并且恢復至正常水平(均P＞0.05)。動情前期及動情后期各組之間比較差異無統計學意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 各組之間動情周期比較(±s)

表1 各組之間動情周期比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05。

/d正常組組別 動物數/只動情周期/d動情間期/d動情前期/d動情后期10 4.1 ±0.4 1.4 ±0.3 1.5 ±0.4 1.7 ±0.5模型組 10 5.0 ±0.9* 2.1 ±0.5* 1.8 ±0.7 1.9 ±0.7治療后 10 4.3 ±0.7# 1.7 ±0.4#1.7 ±0.5 1.9 ±0.6

2.3 血清E2、P值變化 與正常組比較，模型組血清 E2、P值降低，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，治療組血清E2、P值升高，差異有統計學意義(均P＜0.05)，并且均恢復至正常水平(均P＞0.05)。(見表2)

表2 各組之間血清E2、P值比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05。

組別 動物數/只 E2/(pg·mL－1) P/(ng·mL－1)正常組10 41.32 ±15.02 4.87 ±0.79模型組 10 26.03 ±10.90* 3.62 ±0.61＊＊治療組 10 38.64 ±13.73# 4.51 ±0.71#

2.4 子宮內膜ER、PR平均光密度值變化 與正常組比較，模型組子宮內膜ER、PR表達降低，差異有統計學意義(均P＜0.01);與模型組比較，治療組子宮內膜ER、PR表達增強，差異有統計學意義(均P＜0.05)，ER表達恢復至正常水平(P ＞0.05)。(見表3)

表3 各組之間子宮內膜ER、PR平均光密度值比較(±s)

表3 各組之間子宮內膜ER、PR平均光密度值比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05。

ER PR正常組組別 動物數/只10 253.86 ±26.72 207.84 ±23.66模型組 10 211.03 ±23.11＊＊ 163.22 ±18.78＊＊治療組 10 236.81 ±24.43# 185.91 ±20.01*#

3 討論

“婦人以血為本”，寒為陰邪，性主收引、凝滯，極易與血搏結。寒客沖任、胞宮，可使經脈拘攣，血行瘀滯，“不通則痛”，發為痛經;或沖任、胞脈被阻，胞宮不能按時滿盈，而導致月經后期月經過少、閉經、不孕癥等。根據“寒者熱之”、“結者散之”的治則，我們擬定溫經散寒、活血化瘀調經之加減溫經湯。前期臨床及實驗研究已證實本方可通過改善生殖內分泌激素、調節致痛及鎮痛物質，改善卵巢功能，治療寒凝血瘀型婦科疾病［5-8］。本實驗從子宮內膜受體方面進一步完善其作用機制。

正常婦女的月經周期中，子宮內膜ER、PR呈周期性變化，在增殖期雌激素促進子宮內膜 ER、PR的合成，ER、PR含量逐漸增加，于增殖末期達高峰。在分泌期，由于孕激素抑制子宮內膜ER、PR的合成，子宮內膜ER、PR含量均下降［2］。子宮內膜ER、PR的異常表達將影響E2和P值對內膜的發育、合成和分泌功能，影響子宮內膜生長［9-10］。女性激素水平及子宮內膜組織中相應受體含量任一方面減低或功能異常，都可使子宮內膜發生形態或功能的改變，繼而影響婦女正常的經孕過程［11-13］。

本實驗結果顯示，寒凝血瘀模型組大鼠外觀及精神均欠佳。陰道細胞雖呈周期性變化，但表現為動情周期延長，主要是動情間期延長。模型組大鼠血清E2、P值較正常組明顯下降，子宮內膜ER、PR表達亦降低;經加減溫經湯治療后，血清E2、P值水平升高，子宮內膜ER、PR表達增強，且血清E2、P值及子宮內膜ER表達恢復至正常水平。表明加減溫經湯可調節卵巢激素水平，增強子宮內膜ER、PR的表達，修復寒邪對子宮內膜的損傷，調節HPOA，使其達到一種平衡狀態，綜合作用下達到治療寒凝血瘀型婦科疾病的目的。本實驗卵巢激素水平、子宮內膜受體表達從兩方面，揭示了寒凝血瘀型婦科疾病發生的生物學機制，完善了加減溫經湯治療寒凝血瘀型婦科疾病的機理。

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