無啟動子轉化策略用于分離組織特異性啟動子的研究

吳旭乾，何光源

(1.武漢軟件工程職業學院環境與生化工程系，湖北 武漢 430205；2.華中科技大學生命學院，湖北 武漢 430074)

啟動子按作用方式可分為廣譜啟動子和組織特異性啟動子。近年來,人們相繼分離、鑒定了許多特異表達基因的啟動子,如玉米醇溶蛋白基因B4 啟動子、水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子、大豆7S 種子特異性啟動子[1]、水稻花藥特異表達基因啟動子[2]、煙草花藥特異表達基因啟動子[3]等，但麥類作物的此類啟動子報道甚少。

tritordeum[4]為硬粒小麥(Triticumdurum)和大麥(Hordeumchilense)的雜交種，其基因組含有小麥的AA、BB和大麥的HchHch。供試材料轉基因tritordeum中使用的轉化質粒載體的構建如下：首先從pAct1-DGUS中用雙酶切BamHⅠ/XbaⅠ分離出細菌uidA基因和nos終止子片段；隨后引入到pBluescriptⅡ骨架形成質粒pPLGUS；再從pAHCI7中以酶切Bg/Ⅱ/BamHⅠ獲得含有來源于玉米的40 bp的外顯子序列和ubiquitin-1內含子序列，已知該序列的插入會增強啟動子的驅動，有利于檢測出所標定的弱啟動子序列，并將其克隆到pPLGUS的BamHⅠ位點，最后形成轉化載體——pPLubiGUS，如圖1所示[5]。

圖1 含無啟動子標記載體的部分結構

基因槍法是小麥遺傳轉化中應用最為廣泛的一種方法，以植物組織、愈傷組織、懸浮細胞系、甚至直接以胚作為轉受體，具有無宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高、操作簡便快速等優點。應用基因槍轉化技術將pPLubiGUS載體轉化到受體材料tritordeum中，得到了一批轉基因材料，為無啟動子轉化策略用于分離組織特異性啟動子的研究提供了可能性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

生長期的轉基因植株：以tritordeum為受體的轉基因材料的后代經過種子的發芽處理、播種、日常看護等過程得到。

NLS(Nuclei lysis solution)，PPS(Protein precipitate solution)，10×RNase緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris，15 mmol·L-1NaCl，pH值7.5)，RNase溶液(10 mg·mL-1)，異丙醇，100×TE緩沖溶液(1 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1EDTA)，液氮，10×TBE緩沖溶液，EB溶液，瓊脂糖凝膠，6×載樣緩沖溶液，λDNA Marker，X-Gluc緩沖溶液，Triton X-100，70%～100%梯度乙醇等。

T1 Thermocycler；穩壓穩流電泳儀；精密pH計；HH-W21-420型多用恒溫水箱；Gel-doc型凝膠成像儀，BIO-RAD公司；紅外線加熱微波爐；303AS-2型電熱培養箱；96孔微滴定板；XSJ-2型光學顯微鏡；數碼攝影機。

1.2 方法

1.2.1 葉片總DNA的提取

葉片總DNA的提取參照文獻[4]。

1.2.2 PCR擴增uidA基因

(1)引物設計

基于uidA序列設計引物：

上游P1：5′-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC-3′

下游P2：5′-ATCGCCGCTTTGGACATACCAT-CCGTA-3′

分別起始于uidA序列的376、1431位點。

(2)PCR反應體系

DNA模板1.0 μL、引物P1和P2各0.2 μL、AB1.1 Master mixture 9.7 μL，混勻。

(3)PCR運行程序

94 ℃變性4 min；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，94 ℃變性30 s，30個循環；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸8 min；4 ℃ 保溫。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

根據欲分離DNA片斷大小配制適宜濃度的瓊脂糖溶液，檢測總DNA時用0.6%凝膠，檢測PCR產物時用1.0%凝膠；待熔化的凝膠稍冷卻后加入EB溶液，使終濃度達到0.5 μg·mL-1，輕輕旋轉以混合均勻；電泳結束，用凝膠成像系統檢測EB染色的凝膠。

1.2.4 GUS組織化學檢測

由于uidA基因的表達產物是β-葡糖醛酸酶，若以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)為反應底物，在酶的活性部位會產生藍色沉淀，顯微觀察即可分析uidA表達的組織特異性。

取材部位：三葉期(葉尖、葉中、葉基、葉鞘及根尖)、3～4個分蘗期(葉尖、葉中、葉基、葉鞘及根尖)、剛抽穗之前兩節點及中間部分、幼穗、發育早期的花藥及花粉粒、成熟期花藥及花粉粒。

檢測步驟：將72 μL X-Gluc緩沖溶液加入到微孔板中，再加入0.1 BV的1% Triton X-100；將植物材料切成小片段，用70%乙醇漂洗后再用無菌雙蒸水清洗，置于含X-Gluc的微孔中；用粘性蓋或Nescofilm密封微孔板，置于潮濕間內，防止小體積溶液蒸發干燥；37 ℃過夜，然后于室溫放置2～3 d(37 ℃是酶反應的最適溫度，產生藍色沉淀，而室溫放置會使顏色加深)；若材料呈深綠色，藍色顯色反應將難以檢測。可用70%～100%梯度乙醇代替X-Gluc緩沖溶液去除葉綠素(根據顏色深淺可多次重復)，用1 mol·L-1Tris-HCl(pH值9.5)代替乙醇置4 ℃長時間保存；記錄藍色顯色反應情況。

2 結果與討論

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果

提取出的葉片總DNA用0.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，結果見圖2。

2.2 PCR擴增結果(圖3)

1.DNA Marker Ⅱ 2.陽性對照B73-6-1 3～11.供試樣品

兩引物間的物理距離為1055 bp，uidA基因的PCR結果顯陽性的單株，其特異性的擴增條帶應與此相當。由圖3可看出，4#、7#供試樣品含有uidA基因。

2.3 GUS組織化學檢測結果

2.3.1 陽性對照材料中Gus的表達情況

陽性對照材料B73-6-1(uidA由廣譜型啟動子CaMV35S驅動表達)中外源Gus的表達結果見圖4。

a～f：根，葉，葉基，發育早期的花藥，花藥，花粉粒

由圖4可看出，陽性對照材料的各組織部位均出現了uidA的強烈表達。

2.3.2 供試材料中Gus的表達情況

經PCR所篩選出的轉基因tritordeum中外源Gus的表達結果見圖5。

a～f：葉片，根，幼穗，發育早期的花藥，花藥，花粉粒

由圖5可看出，除了幼穗中花藥原基部位有β-葡糖醛酸酶活性外，其它組織或器官中均未發現有Gus表達的現象。

2.4 討論

應用已知的基因序列和未知基因進行分離，是目前常用的啟動子分離策略。第一種方法已經應用了很長時間，主要是利用已知基因序列制得的探針來搜尋基因文庫，或者是從已知基因序列的5′端進行“步移技術”(Walking)。第二種是基因標記(Tagging)探索技術，通過將無啟動子的標記基因(如Gus)導入受體細胞來實現的，標記調節序列的效果通過檢測轉基因植物中標記基因的表達情況來確定[6]，這種方法已被成功地應用于擬南芥、土豆和煙草等植物的調節序列的標記[7]。有時，在構建含無啟動子uidA基因轉化載體時，有意識地在緊靠uidA位點上游插入內含子序列，已知該序列有增強基因表達的效應，此內含子的插入，可增加那些被標定的弱的內源性啟動子的檢出機會[8]。

3 結論

通過研究外源uidA基因在體內表達的時空特異性，利用PCR、GUS組織化學檢測等技術，從以tritordeum為受體、經無啟動子uidA轉化策略得到的轉基因供試材料中成功篩選出了外源uidA基因在花藥原基特異表達的單株。本研究結果表明，在進行遺傳轉化時，無啟動子的uidA插入到tritordeum某一內源性調控序列的后面，能夠引起uidA的表達，并且表達部位僅限于花藥原基部位。可以確定，該序列是花藥原基特異表達基因的啟動子。

應用無啟動子轉化策略，為標定內源性啟動子提供了一種有效的手段，有著廣闊的應用前景。

[1] 朱亞蘭,姚偉，竇建華，等.種子特異表達啟動子的克隆分析及其植物表達載體的構建[J].華北農學報,2007,22(2):6-10.

[2] 張曉國,劉玉樂，康良儀，等.水稻花藥特異表達基因啟動子的擴增及克隆[J].武漢大學學報(自然科學版),1997,43(4):480-484.

[3] 彭仁旺,周雪榮，周奕華，等.煙草花藥特異表達基因啟動子的克隆及序列分析[J].生物工程學報,1996,12(3):247-250.

[4] 何光源,吳旭乾，涂知明，等.轉基因tritordeum的遺傳分析[J].華中科技大學學報(自然科學版),2005,33(8):94-96.

[5] Salgueiro S,Matthes M，Gil J,et al.Insertional tagging of regulatory sequences in tritordeum,a hexaploid cereal species[J].Theor Appl Genet，2002，104(6-7)：916-925.

[6] Springer P S.Gene traps:Tools for plant development and genomics[J].The Plant Cell，2000，12(7)：1007-1020.

[7] Kertbundit S，de Greve H，Deboeck F，et al.Invivorandomβ-glucuronidase gene fusions inArabidopsisthaliana[J].Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(12)：5212-5216.

[8] McFadden E S，Sears E R.The origin ofTriticumspeltaand its free-threshing hexaploid relatives[J].J Hered，1946，37(3)：81-89.