乙基纖維素固定化α-淀粉酶的研究

郭 青,周小凡

(南京林業大學輕工科學與技術學院，江蘇 南京 210037)

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)在動物、植物及微生物中均有分布，可隨機作用于淀粉、糖原、多聚糖或寡糖分子的α-1,4葡萄糖苷鍵，將其降解為葡萄糖、麥芽糖和低聚糖等，是應用最早、最廣泛的工業酶制劑之一，其應用涉及食品工業、釀造發酵工業、紡織品工業、造紙工業和醫藥工業等多個領域[1～6]。α-淀粉酶雖可從動物、植物中提取，但其大規模化工業生產仍然采用微生物發酵法。乙基纖維素(Ethyl cellulose，EC)因其優良的抗水性、成膜性和化學惰性，廣泛用于藥物骨架、包衣材料、包囊輔材、載體材料、片劑粘合劑[7～9]等藥物制劑的制備。作者在此采用物理包埋技術，以PVA海綿作為載體，在其充分吸收α-淀粉酶后，反復浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在載體表面及內部形成一層薄膜，從而完成對α-淀粉酶的固定化。并研究了固定化α-淀粉酶的特性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

PVA海綿，寧波智德清潔用品有限公司。裁剪成3 mm×3 mm×3 mm的小顆粒，備用。

α-淀粉酶，北京奧博星生物技術有限責任公司；乙基纖維素(M70)，國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純，國藥集團。

HH-S型恒溫水浴鍋，上海葉拓儀器儀表有限公司；7230G型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C型數顯pH計，上海康儀儀器有限公司；電子天平(Max=120 g,d=0.1 mg)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；JJ-791型磁力攪拌器，江蘇金壇宏凱儀器廠。

1.2 固定化方法

取1 gα-淀粉酶放入100 mL去離子水中于40 ℃恒溫活化30 min，過濾，去除雜質；EC用乙酸乙酯配制成0.50%的溶液。

將1 mL活化的α-淀粉酶與50 mg PVA海綿放入燒杯中，反復擠壓混勻2 min，使PVA海綿充分吸收酶液；再將PVA海綿擠干，經流動空氣干燥至含水量約80%；將吸收了酶液的PVA海綿轉移入燒杯，加入2 mL 0.50%(質量分數，下同)EC溶液，反復擠壓3 min左右，使PVA海綿與EC溶液充分混合，然后放入4 ℃冰箱中干燥；再浸泡吸收EC溶液，進行二次固定化和干燥，即得固定化α-淀粉酶。

1.3 酶活測定

α-淀粉酶的活力采用碘-淀粉比色法測定[10]。

α-淀粉酶活力單位定義:40 ℃下，100 mL酶濾液(1 g酶粉)中的酶與底物淀粉作用30 min，水解10 mg淀粉為1個酶活力單位。

2 結果與討論

2.1 固定化工藝條件的優化

2.1.1 干燥方式對固定化α-淀粉酶的影響

固定化α-淀粉酶的固定化干燥過程實質上是乙酸乙酯溶劑蒸發的過程，也是EC從液相轉化為固相的成膜過程。隨著乙酸乙酯溶劑的蒸發，EC體系粘度逐漸增大，直至最后成為固體。

保持其它固定化條件不變，將α-淀粉酶分別在室溫25 ℃和冰箱4 ℃條件下干燥，考察不同干燥方式對固定化α-淀粉酶重復操作穩定性的影響，結果見圖1。

圖1 干燥方式對固定化α-淀粉酶的重復操作穩定性的影響

由圖1可看出，在室溫25 ℃干燥時，固定化α-淀粉酶的重復操作穩定性較差，相對酶活較低，并隨著重復操作次數的增加而持續下降；在冰箱4 ℃干燥時，首次相對酶活很高，達到130%左右，自第2次開始有所下降，但基本維持在較穩定的水平。與室溫25 ℃干燥方式相比，4 ℃干燥的固定化α-淀粉酶在重復操作穩定性方面有著明顯的優勢，經多次重復使用后仍有活力。這是由于，乙酸乙酯在4 ℃時的蒸發速度較25 ℃時的蒸發速度慢，使得4 ℃下成膜的EC具有更小、更致密的膜孔，在PVA海綿內部及表面的α-淀粉酶不易泄漏，從而表現出更好的重復操作穩定性。因此，選擇冰箱4 ℃的干燥方式。

2.1.2 EC質量分數對固定化α-淀粉酶的影響

保持其它固定化條件不變，將EC用乙酸乙酯配制成不同質量分數：0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，考察EC質量分數對固定化α-淀粉酶重復操作穩定性的影響，結果見圖2。

圖2 EC質量分數對固定化α-淀粉酶重復操作穩定性的影響

由圖2可看出，EC質量分數較低(0.50%)時，固定化α-淀粉酶的相對酶活較高，重復操作性較好；隨著EC質量分數的升高，相對酶活逐漸下降；當EC質量分數超過0.75%后，固定化α-淀粉酶的重復操作穩定性較好，但相對酶活普遍較低。這可能與PVA海綿內部孔道是否暢通有關，當EC質量分數較高時，PVA海綿孔道中因過多的EC而造成堵塞。由圖2還可看出，固定化α-淀粉酶經過第1次反應后，第2次的相對酶活大幅下降，這可能是由于，第1次反應時生成的產物及反應底物將PVA海綿內部孔道進一步堵塞，從而導致2次操作后的相對酶活下降。綜合考慮α-固定化酶活力和重復操作穩定性，選擇EC質量分數為0.50%。

2.1.3α-淀粉酶濃度對固定化α-淀粉酶的影響

保持其它固定化條件不變，將α-淀粉酶酶液配成一系列不同濃度(g·L-1)：1、2、3、4、5、6、7，考察α-淀粉酶濃度對固定化α-淀粉酶重復操作穩定性的影響，結果見圖3。

圖3 α-淀粉酶濃度對固定化α-淀粉酶重復操作穩定性的影響

由圖3可看出，在第1次操作時，隨著α-淀粉酶濃度的增大，固定化酶活力有所提高，但是酶液濃度超過2 g·L-1后，固定化酶活力隨著酶液濃度的增大反而略有下降。這可能與PVA海綿載體的酶負載量有關。當PVA海綿的酶負載量達到飽和時，固定化酶表現出最大活力。由圖3還可看出，酶液濃度較高時，均表現出較好的重復操作穩定性。綜合考慮固定化α-淀粉酶活力和重復操作穩定性，選擇α-淀粉酶濃度為4 g·L-1。

2.2 固定化α-淀粉酶的性質

2.2.1 最適反應pH值

40 ℃下，選取不同pH值的淀粉溶液分別與游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶反應，考察游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶的最適反應pH值，結果見圖4。

圖4 游離酶和固定化酶的最適反應pH值

當酶被固定在某一介質內部或載體表面時，由于載體的特性不同，pH值對酶活力的影響也不一樣[11]。由圖4可看出，游離α-淀粉酶的最適反應pH值為6.0，而固定化α-淀粉酶的最適反應pH值為7.0，α-淀粉酶經固定化后，最適反應pH值往堿性方向移動了1個單位。因此，后續固定化α-淀粉酶性質檢測均在pH值7.0的條件下進行。

2.2.2 最適反應溫度

在pH值為6.0的條件下，考察游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶在30～70 ℃的酶活力，結果見圖5。

圖5 游離酶和固定化酶的最適反應溫度

由圖5可看出，游離α-淀粉酶的最適反應溫度為50 ℃，固定化α-淀粉酶的最適反應溫度為60 ℃。相對游離α-淀粉酶，固定化α-淀粉酶的最適反應溫度升高了近10 ℃，且在各溫度點都表現出更高的酶活力。可見，α-淀粉酶經固定化后，最適反應溫度有所提高，在60 ℃時活力達到最高。

2.2.3 熱穩定性

分別將固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶放在70 ℃烘箱中保溫，每隔20 min取出部分樣品，冷卻至室溫25 ℃，測定酶活力，結果見圖6。

圖6 70 ℃下游離酶和固定化酶的熱穩定性

由圖6可看出，隨著保溫時間的延長，固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶的酶活力都逐漸下降；保溫140 min后，游離α-淀粉酶已近完全失活，而固定化α-淀粉酶仍保持初始酶活的40%左右。可見，α-淀粉酶經固定化后熱穩定性得到了提高。這可能與固定化方法有關，相比共價固定或物理吸附固定，經包埋固定的酶的熱穩定性大多會得到提高[12]。

2.2.4 重復使用性

固定化酶的重復使用性是衡量固定化酶性質的重要指標之一。在pH值7.0、25 ℃下，用紗網過濾取出固定化α-淀粉酶，用蒸餾水沖洗3次，以去除表面的底物和產物溶液，然后重復使用，測其酶活。連續重復使用10次的結果見圖7。

圖7 固定化α-淀粉酶的重復使用性

由圖7可看出，第1次使用時酶活力很高；第2次使用時酶活力大幅下降，但仍保持在一個較高的水平；從第7次使用開始酶活力又進一步逐漸下降。這可能是由于，酶部分泄漏或者傳質通道被底物或產物堵塞，減少了酶與底物接觸的機會，增大了擴散限制對固定化α-淀粉酶活力的影響，從而導致固定化α-淀粉酶的活力下降。這表明，以PVA海綿為載體，再以EC包裹載體包埋制得的固定化α-淀粉酶具有一定的重復使用性。

2.2.5 儲存穩定性

將游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶儲存于4 ℃冰箱中，每隔4 d檢測一次酶活力，結果見圖8。

圖8 游離酶和固定化酶的儲存穩定性

由圖8可看出，固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶的活力均隨著儲存時間的延長而降低，儲存32 d后，固定化α-淀粉酶仍能保持初始酶活的60%左右，而游離α-淀粉酶只保留初始酶活的4%左右。可見，α-淀粉酶經固定化后儲存穩定性顯著提高。

3 結論

以PVA海綿作為載體，充分吸收α-淀粉酶后，反復浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在載體表面及內部形成一層薄膜，從而完成對α-淀粉酶的固定化。該方法操作簡便，減少了酶變性的可能，最大程度保留了酶活力。此法制得的固定化α-淀粉酶具有良好的熱穩定性、重復使用性和儲存穩定性，其最適反應pH值為7.0、最適反應溫度為60 ℃。該方法理論上適用于所有酶的固定化，并且可以使用其它成膜材料代替EC，具有廣闊的應用前景。

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