低溫脂肪酶產生菌Trichosporon pullulans的脂肪酶基因克隆

肖 冬

(陜西核工業二一一地質大隊分析測試中心，陜西 西安 710024)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是分解脂肪的酶，在動植物組織及微生物中普遍存在，自1834年兔胰脂肪酶的活性報道至今，有關脂肪酶的研究已有上百年的歷史[1]，脂肪酶的自然底物是在水中微溶的長鏈三酰甘油酯[2]，催化反應發生在水與有機相的交接處，微粒狀態下的脂肪酶能很好地催化酯化、醇化、酸化反應[3～12]。

脂肪酶產生菌主要來自系統分析樹的兩大分支：一個是原核細胞細菌，另一個是真核細胞，包括動物、植物、真菌以及古細菌[13]。工業用脂肪酶多來源于微生物，產脂肪酶的菌類主要有黑曲霉菌、熒光假單胞菌、白地霉無根根霉菌、毛霉圓柱假絲酵母菌、巢子須霉德氏根霉菌、多球菌綿毛狀腐質霉菌、圓弧青霉粘質色桿菌等。

有關細菌脂肪酶的分子生物學，已測定了假單胞菌、葡萄球菌、鏈霉菌和枯草桿菌等眾多細菌脂肪酶的基因序列和對應的氨基酸序列[14，15]。

目前，脂肪酶已廣泛應用于工業生產領域，每年約有1000 t脂肪酶應用于約130 億t 去污劑的生產，而用于油脂化學轉化中的脂肪酶相對少一些。脂肪酶可以用于多不飽和脂肪酸(γ-亞麻酸)、食物色素(蝦青素)、典型藍干酪的氣味分子(甲基酮)和水果香料(4-羥基癸酸)的生產；還可用作甘油酯中的酯交換替代品(如生產巧克力中可可脂的替代品)；可通過脂肪酶修飾植物油中的三酰甘油制得嬰兒食品中的人乳脂肪類似物；可用于化妝品的生產；可用作食品業和制藥業中重要的乳化劑；可在藥物的生產中合成單一異構體，如抗炎藥物萘普生和異丁苯丙酸、血管緊張肽轉化酶抑制子(如卡托普利、依那普利、賴諾普利)以及鈣離子通道藥物硫氮草酮等。隨著酶學研究的快速發展，微生物脂肪酶的應用領域仍將不斷擴展，可以預測，脂肪酶將成為重要的工業生產酶。

作者在此對低溫脂肪酶產生菌Trichosporonpullulans的脂肪酶基因進行了克隆，并對PCR擴增條件進行了優化。

1 實驗

1.1 菌株

菌株5-1(酵母Trichosporonpullulans茁芽絲孢酵母屬)，將新鮮的0.5 mL菌液與0.5 mL 40%(體積分數)滅菌甘油充分混合后，置-80 ℃存放。

1.2 試劑與儀器

DNA回收試劑盒，TIANGEN BIOTECH；1 kb plus DNA Ladder﹑1 kb DNA Ladder、LA Taq酶、蛋白酶K，天為時代；dNTPs﹑Taq DNA 聚合酶、10×LA buffer、6×loading buffer，TakaRa；Tris堿，Novon；CTAB，amresco；其它試劑均為國產分析純。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

立式高速冷凍離心機，長沙湘儀；臺式高速冷凍離心機，江西日博工貿有限公司；PCR儀，Techne公司；制冰機，美國格蘭特中國制冷設備制造有限公司；移液槍，上海之信儀器有限公司；超凈臺，蘇州凈化；滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；電泳儀，北京六一儀器制造廠。

1.3 培養基及培養條件

1.3.1 培養基

高氏Ⅰ號液體培養基：2%可溶性淀粉，0.1% KNO3，0.05% K2HPO4，0.05% NaCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.001% FeSO4·7H2O，pH值7.2～7.4。用去離子水配制，使用前于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.2 培養條件

30 ℃、130 r·min-1搖床培養2～3 d。

1.4 緩沖溶液

所有溶液均用超純去離子水配制，使用前經過高壓濕熱滅菌或者溶液的成分單獨滅菌。

(1)1×TE buffer：10 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+10 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(2)Tris-HCl：1 mol·L-1Tris用HCl調節至適當的pH值。

(3)Tris飽和苯酚：苯酚用100 mmol·L-1Tris-HCl(pH值5.0)飽和。

(4)苯酚-氯仿：飽和苯酚與氯仿以1∶1(體積比)混合。

(5)TAE：40 mmol·L-1Tris-醋酸+1 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(6)10×TBE：900 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+900 mmol·L-1Boric-acid+20 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

(7)溶菌酶混合液：2 mg·mL-1溶菌酶+50 μg·mL-1Rnase+0.3 mol·L-1蔗糖+25 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)+25 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)。

以20 mL為例：溶菌酶40.0 mg；Rnase 1 mg(10 mg·mL-1Rnase水溶液100 μL，1 mg·mL-1Rnase水溶液1 mL)；蔗糖0.006 mol，約2.054 g；50 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)10 mL，0.0606 g；0.5 mol·L-1EDTA 1.0 mL，0.1861 g。

(8)DNA提取液：100 mmol·L-1Tris-HCl+100 mmol·L-1EDTA+100 mmol·L-1Na2PO3+1.5 mol·L-1NaCl+1% CTAB，pH值8.0。

(9)3 mol·L-1NaAc：40.8 g NaAc·3H2O，加水40 mL溶解，加冰醋酸調pH值5.2，定容100 mL。

1.5 方法

1.5．1 模板DNA(基因組DNA)的提取

1.5.1.1 CTAB法[16]

(1)取培養1～2 d的菌液20 mL于10 000 r·min-1離心10 min，取50 mg菌泥加500 μL無菌水清洗，離心，取沉淀，加入100 μL TE反復凍融2～3次，在-80～-65 ℃冰箱中放置1 h以上，再高溫(100 ℃)水浴1 min。

(2)離心(13 000 r·min-1,5 min)后取出TE，沉淀加135 μL DNA提取液，再加1 μL 10 mg·mL-1蛋白酶K于37 ℃水浴0.5 h(不時振蕩)。

(3)加15 μL 20% SDS至終濃度為2%，于65 ℃水浴1.5 h(不時混勻)。

(4)離心(13 000 r·min-1，5 min)，取上清與上兩步的TE合并。

(5)用等體積酚(可省略)、苯酚-氯仿(用前靜置過夜)、氯仿依次抽提，混勻后靜置，離心(13 000 r·min-1，5 min)，取上清。

(6)加0.6～1 BV的異丙醇常溫沉淀1 h，然后離心(13 000 r·min-1，15 min)。

(7)沉淀用70%乙醇清洗，離心(7500 r·min-1，5 min)，取沉淀烘干后用30 μL無菌水溶解。

(8)DNA的純化：取提取的DNA溶液10 μL，按溶菌酶中Rnase的濃度,加入0.1 μL 10 mg·mL-1Rnase,于37 ℃水浴30 min；加入1 μL(1/10)的NaAc(3 mol·L-1，pH值5.2)，再加入33 μL[(10+1)×3]無乙水醇；放入-20 ℃冰箱內冷藏20 min；離心(13 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，棄上清；用500 μL 70%乙醇洗滌沉淀，離心(13 000 r·min-1，5 min)，烘干，加10 μL無菌水溶解。

1.5.1.2 酶法

(1)取培養1～2 d的菌液20 mL于10 000 r·min-1離心10 min，取50 mg菌泥加500 μL無菌水清洗，離心，取沉淀，加入100 μL TE反復凍融2～3次，在-80～-65 ℃冰箱中放置1 h以上，再高溫(100 ℃)水浴1 min，凍融后離心(13 000 r·min-1，5 min)，取沉淀。

(2)將沉淀重懸于500 μL溶菌酶混合液，37 ℃溫育0.5～1 h，再補加酶液100 μL，于40～50 ℃繼續保溫30 min。

(3)菌液透明后，加20%SDS至終濃度為2%(500 μL +100 μL+65 μL=665 μL，65/665≈1/5)，攪拌約5 min至菌液粘度顯著下降，離心(15 000～13 000 r·min-1，5～10 min)，取上清。

(4)將上清用等體積酚(可省略)、苯酚-氯仿(用前靜置過夜)、氯仿依次抽提，混勻后靜置，離心(14 000～12 600 r·min-1，5 min)，取上清。

(5)加0.8 BV的異丙醇常溫沉淀10～40 min，離心(13 000 r·min-1，15 min)，取沉淀。

(6)將沉淀用70%乙醇清洗，離心(7500 r·min-1，5 min)，取沉淀，烘干后用30 μL無菌水溶解。

(7)DNA的純化：同CTAB法。

1.5.2 DNA的檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的大小、含量及質量。

(1)制備平板瓊脂糖凝膠。

(2)在DNA液中，加入6×loading buffer上樣緩沖溶液。

(3)將含上樣緩沖溶液的DNA液點入凝膠的加樣孔，并以標準DNA(1 kb DNA Ladder)作對照。

(4)藍色指示劑離膠前沿1/3處；電泳完畢，EB染色30 min，紫外燈下觀察、照相。

分離觀察大片段時用稀膠(0.8%)、醋酸緩沖溶液(TAE：40 mmol·L-1Tris-醋酸，1 mmol·L-1EDTA)；檢測小片段時用濃膠(1.0%)，硼酸緩沖溶液(TBE:0.089 mol·L-1Tris-硼酸，0.0002 mol·L-1EDTA，pH值5.0)。

1.5.3 18S rDNA基因鑒定

使用引物18SF、18SR，以待檢菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，采用1%瓊脂糖電泳觀察結果。DNA試劑盒回收PCR 產物,送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

18SF：5′-AGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′

18SR：5′-TAATGATCCTTCCGCAGGTT-3′

反應體系：

ddH2O 34.6 μL，10×LA buffer 5 μL，dNTP 4 μL，18SF 0.5 μL，18SR 0.5 μL，LA Taq酶0.4 μL，模板DNA 5 μL，總體積50 μL。

PCR擴增程序：95 ℃變性8 min；94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸4 min，32個循環；72 ℃延伸8 min。

1.5.4 脂肪酶基因PCR擴增條件的優化

根據不同菌株的脂肪酶基因中的相同區段設計引物TYLipR、TYLipF。

反應體系終體積為25 μL，模板DNA 為原液或稀釋液，其余部分用超純水補足。

使用引物TYLipR、TYLipF，以待檢菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增,設置反應體系如下：10×LA buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，TYLipR 0.5 μL，TYLipF 0.5 μL，LA Taq酶0.2 μL。

TYLipR：5′-CAGGTTGCCSGCRCTRTCNCC-3′

TYLipF：5′-GTGGTGTAYTTYCAYGGBGG-3′

將模板量、退火溫度設為不同梯度，進行PCR 擴增以確定最佳反應體系。PCR 產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,記錄結果。

1.5.4.1 模板量

以CTAB法提取的DNA為模板(模板量分別設置為：100倍稀釋DNA原液、10倍稀釋DNA原液、DNA原液)，進行PCR 擴增，然后根據凝膠電泳條帶的結果進行調整。

1.5.4.2 退火溫度

(1)退火溫度首先設置為55 ℃、45 ℃兩個梯度。PCR擴增程序為：95 ℃變性3 min；94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸3 min，32個循環；72 ℃延伸5 min。

(2)由于樣本出現多條帶，所以需對PCR擴增程序進行優化：

95 ℃變性3 min；10 個循環為94 ℃變性0.5 min，50～45 ℃(依次降低0.5 ℃，10次循環至45 ℃)復性0.5 min；72 ℃延伸3 min；后22個循環為94 ℃變性0.5 min,45 ℃復性0.5 min，72 ℃延伸3 min。10 ℃保存。

2 結果與討論

2.1 DNA提取結果

分別用酶法、CTAB法提取DNA后，取4 μL或5 μL在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳20 min，結果見圖1。

M.Marker 1.4 μL DNA 2.5 μL DNA

由圖1可看出，由于初步提取的DNA意外含有大量RNA片段,因此在DNA純化步驟前應先降解RNA。其添加的RNA酶與溶菌酶混合液中RNA酶濃度一致。

降解RNA后進行DNA純化，取2.5 μL純化后的DNA溶液，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳20 min，結果見圖2。

M.Marker 1.酶法提取DNA 2.CTAB法提取DNA

由圖2可看出，DNA片段較圖1降解充分，其中CTAB法提取的DNA片段長度更長，說明基因組DNA更完整，且CTAB法提取的DNA濃度更高，較酶法效果更好；但CTAB法提取DNA的操作過于劇烈，導致DNA斷裂比較嚴重。

2.2 18S rDNA基因鑒定結果

利用引物18SF、18SR進行18S rDNA PCR擴增，回收后取1 μL產物參照3 μL Marker進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。

M.Marker 1.18S rDNA

由圖3可知，18S rDNA序列大小為1600 bp。

將18S rDNA送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，結果見圖4。

圖4 18S rDNA測序結果

核苷酸序列分析表明，該菌的18S rDNA核苷酸序列與酵母Trichosporonpullulans茁芽絲孢酵母屬的同源性高達99%，在細菌系統分類學上，初步鑒定菌株5-1為茁芽絲孢酵母屬。

2.3 脂肪酶基因的PCR擴增初步優化結果

2.3.1 DNA模板量的確定

模板為DNA原液及其10倍稀釋、100倍稀釋的PCR擴增產物的電泳圖見圖5。

M.Marker 1.空白對照 2.模板為100倍稀釋DNA 3.模板為10倍稀釋DNA 4.模板為原液DNA 5、6.空白

通過比較，模板為10倍稀釋DNA原液、100倍稀釋DNA原液時，沒有目的基因產生，而克隆的模板為DNA原液時，盡管擴增的目的基因特異性不強，但很明顯。因此，后續研究的模板量選擇0.5 μL的DNA原液。

2.3.2 退火(復性)溫度的確定

不同退火溫度時，PCR擴增產物的電泳圖見圖6。

M.Marker 1.55 ℃ 2.45 ℃ 3、4.空白 5.55～45 ℃梯度降低

由圖6可知，退火溫度過高(55 ℃)時，引物與模板不易結合，PCR 反應效率降低,目標條帶亮度降低甚至消失；退火溫度過低(45 ℃)時產生雜帶即非特異結合增加；退火溫度在55～45 ℃，隨著循環梯度降低，增加了特異性片段，主要片段長度由2000 bp以上調整為1～2000 bp。

2.4 討論

2.4.1 DNA提取方法

本實驗用CTAB法和酶法分別提取酵母基因組DNA。結果表明，CTAB法提取的DNA更完整，效果更好，但DNA的純化不夠完善，電泳圖顯示還有較多雜碎片段；DNA提取過程中，操作不夠規范、熟練，極易造成DNA斷裂、破碎，進而產生雜碎片段。

為此，提出改進方法：操作中更加仔細、輕柔，如：加SDS后用移液槍頭攪拌時，需緩慢輕柔、不要碰管壁等；或者回收DNA瓊脂糖電泳條帶，再次進行電泳，從而純化DNA。

2.4.2 PCR擴增條件的優化

在低溫脂肪酶基因PCR擴增過程中，通過模板量和退火溫度的改變，優化了PCR擴增條件，克隆出明顯的目的基因片段，但是擴增結果有多條亮帶，特異性不強，原因可能是使用的DNA模板純化不充分。通過將PCR非特異性條帶中1000～3000 bp的基因片段回收純化、測序，可以在分子水平上更好地研究脂肪酶基因的性質與結構等。

3 結論

以產低溫脂肪酶菌株5-1為材料,用酶法和CTAB法分別提取基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測亮帶進行比較，結果表明用CTAB法提取的DNA的完整性更好、濃度更高；該菌株通過18S rDNA基因鑒定，即以待檢菌株提取的DNA為模板，以18SF、18SR為引物，進行PCR擴增，由18S rRNA的保守序列分析，鑒定為Trichosporonpullulans茁芽絲孢酵母屬；利用脂肪酶的同源基因片段來設計引物，以該菌株的DNA為模板，進行PCR篩選，克隆脂肪酶基因；并對模板量、退火溫度兩個重要因素進行優化，初步確定最佳PCR擴增條件為：模板量為DNA原液，退火溫度為55～45 ℃梯度降低。

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