黑根霉RN-M246催化甾體的11α-羥基化培養基研究

胡曦予，崔 勵，馮 魁

(大連工業大學輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034)

甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，隨著需求量的不斷增大，其合成技術也得到了越來越廣泛和深入的研究[1]。甾體類藥物的傳統化學合成方法步驟繁瑣、副產品多、產率低且環境污染嚴重，而微生物轉化技術具有專一性強、產率高、條件溫和、污染少等諸多優點，而且其轉化反應類型十分豐富[2]，因此越來越受到重視。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(Androst-4-ene-3,17-dione，AD)是制造甾體激素類藥物的關鍵中間體，常用于制備孕激素、雄激素、皮質激素、避孕藥等[3]，在甾體母核引入羥基，可使其抗炎活性大大增強。其11α-羥基化獲得的11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮是制備治療高血壓及充血性心力衰竭的新型藥物的關鍵中間體，且臨床療效優于其它同類藥物[4]。

作者采用微生物轉化法，以黑根霉(Rhizopusnigricans)RN-M246催化底物雄甾-4-烯-3，17-二酮進行11α-羥基化反應，優化了發酵培養基，以使其有利于菌體生長及轉化，擬為11α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的工業化生產奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株與試劑

黑根霉RN-M246，清華大學生命科學院。

雄甾-4-烯-3,17-二酮，Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 培養基

斜面培養基：小米培養基，pH值自然。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米漿20，蠶蛹粉10，硫酸銨1，磷酸氫二鉀5，pH值5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

黑根霉斜面中加適量無菌水，將孢子洗下，紗布過濾，充分振蕩，制成1×107～1×108個·mL-1孢子懸液。

1.3.2 搖瓶轉化

在500 mL擋板搖瓶中加入75 mL發酵培養基和10 mmol·L-1的底物，滅菌后超聲，接入4%的菌懸液，在28 ℃、160 r·min-1條件下轉化24 h，其后提高轉速至220 r·min-1繼續轉化48 h。

1.3.3 HPLC分析

將發酵液高速離心，取上清液用甲醇稀釋，稀釋液經0.45 μm有機濾膜過濾，作為檢測樣品，進行HPLC分析。色譜條件：C18烷基硅烷鍵合反相柱；流動相為甲醇-水(3∶2，體積比)；流速0.8 mL·min-1；色譜柱溫25 ℃；紫外檢測器波長242 nm。

2 結果與討論

2.1 碳源對轉化反應的影響

碳源是培養基組成的重要成分之一，是菌體生長所需的重要營養物質，同時也影響著轉化反應過程。固定發酵培養基中其它組分不變，分別考察不同碳源(30 g·L-1的葡萄糖、蔗糖、麥芽浸粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、糖蜜)對轉化率的影響，結果見圖1。

圖1 不同碳源對轉化率的影響

由圖1可知，葡萄糖與糊精作為培養基碳源時的轉化率較高。其中，葡萄糖較易被微生物利用并轉化成菌體生長所需的能量和碳成分，且價廉易得，廣泛應用于微生物實驗和工業化生產。因此，選用葡萄糖為最佳碳源。

2.2 速效有機氮源對轉化反應的影響

速效有機氮源中豐富的營養物質能夠快速而直接地被菌體吸收利用，使得菌體能在較短時間內生長，增加菌絲濃度。碳源為葡萄糖，固定發酵培養基中其它組分不變，分別考察不同速效有機氮源(20 g·L-1的蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏)對轉化率的影響，結果見圖2。

圖2 不同速效有機氮源對轉化率的影響

由圖2可知，蛋白胨為速效有機氮源時的轉化率最高，較原培養基中的玉米漿提高了8%。因此，選擇蛋白胨為最佳速效有機氮源。

2.3 遲效氮源對轉化反應的影響

黑根霉轉化AD實驗采用一步轉化法，其發酵周期較長，在培養基中加入遲效氮源利于發酵后期營養物質的供給及代謝產物的形成。碳源為葡萄糖、速效有機氮源為蛋白胨，固定發酵培養基其它組分不變，考察不同遲效氮源(10 g·L-1的蠶蛹粉、冷榨豆粉、熱榨豆粉、麩質粉、玉米蛋白粉)對轉化率的影響，結果見圖3。

圖3 不同遲效氮源對轉化率的影響

由圖3可知，冷榨豆粉作為遲效氮源時的轉化率最高，相對于原培養基轉化率提高了5%。因此，選用冷榨豆粉為最佳遲效氮源。

2.4 無機氮源對轉化反應的影響

碳源為葡萄糖、速效有機氮源為蛋白胨、遲效氮源為冷榨豆粉，固定發酵培養基其它組分不變，考察不同無機氮源(1 g·L-1的乙酸銨、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、檸檬酸三銨)對轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 不同無機氮源對轉化率的影響

由圖4可知，硫酸銨和檸檬酸三銨有助于轉化率的提高。其中，添加硫酸銨的培養基所生長的菌體較易成團，導致轉化率下降，而添加檸檬酸三銨的培養基所生長的菌體分散均勻，在較快的轉速下仍不成團，保證了轉化過程的順利進行，其原因是檸檬酸三銨不僅提供了氮源，還起到了穩定和分散的作用。因此，選用檸檬酸三銨為最佳無機氮源。

2.5 pH值對轉化反應的影響

pH值是影響菌體生長及轉化過程的重要因素之一，不僅影響菌體的生長，同時也影響酶活性。在上述優化的發酵培養基條件下，考察發酵培養基的pH值對轉化率的影響，結果見圖5。

圖5 pH值對轉化率的影響

由圖5可知，發酵培養基pH值為5.0時的轉化率最高，達到48.4%，較原培養基轉化率提高了約13%。因此，選用發酵最佳pH值為5.0。

3 結論

采用微生物轉化法，以黑根霉RN-M246催化雄甾-4-烯-3,17-二酮11α-羥基化反應，考察了發酵培養基對轉化率的影響。研究發現：常用作分散劑的檸檬酸三銨是菌體形態的主要影響因素，有效地改善了菌體易成團的現象，且菌量適中，均勻分散；蛋白胨含有較豐富的氨基酸等營養物質，作為速效有機氮源更有利于菌體在前期成長；而黑根霉的生長及轉化時間較長，添加遲效氮源冷榨豆粉能夠保證發酵后期營養的供給，使菌絲體持續生長并進行轉化反應。

確定優化的發酵培養基(g·L-1)為：葡萄糖30、蛋白胨20、冷榨豆粉10、檸檬酸三銨1、磷酸氫二鉀5、pH值5.0，在此條件下，可提高轉化率約13%，最終轉化率達48.4%。

[1] 郭一平，鄭璞.甾體微生物C11α-羥化反應的研究進展[J].浙江工業大學學報，2004，32(4):437-441.

[2] 張麗青.微生物轉化在甾體藥物合成中的應用[J].中國醫藥工業雜志，1985,18(1):27-41.

[3] 楊英，姜紹通.微生物降解甾醇側鏈轉化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究進展[J].微生物學通報，2006,33(6)：142-145.

[4] Davis K L,Nappi J M.The cardiovascular effects of eplerenone,a selective aldosterone-receptor antagonist[J].Clinical Therapeutics，2003,25(11):2647-2668.