衍生化－高效液相色譜法測定丙戊酸血清濃度＊

鄒小琴，毛桂福，鐘小斌，黃振光

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021; 2.廣西壯族自治區柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001)

丙戊酸鈉是臨床常用的抗癲癇藥，在癲癇患兒的治療過程中，通過監測血藥濃度實現個體化給藥可以提高癲癇的控制率[1－2]和減少不良反應。衍生化－高效液相色譜(HPLC)法[3－7]是目前國內外常用的丙戊酸血藥濃度測定方法，多采用三乙胺為催化劑。本研究以氫氧化鈉乙腈溶液為催化劑，建立了衍生化－HPLC法測定丙戊酸血藥濃度，具有干擾少、簡便快速、靈敏準確等優點，現報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT型四元梯度高效液相色譜系統(LC－20AT泵，Rheodyne7725i型進樣閥，SPD－20A紫外檢測器，CTO－20A柱溫箱，DGU－20A在線脫氣機，日本島津);Hangping FA1004型電子分析天平(上海天平儀器廠);XW－80型漩渦混合器(上海醫科大學實驗儀器廠);80－2S型臺式低速離心機(上海醫療器械〈集團〉有限公司手術器械廠);L－128型氮吹儀(北京來亨科學儀器公司)。丙戊酸鈉對照品(湖南湘中制藥有限公司，含量為99.5%，批號為090405);環己羧酸(梯希愛＜上海＞化成工業發展有限公司，含量＞95.0%);α－溴苯乙酮(A Johnson Mathey Company，含量98%);甲醇、乙腈為色譜純試劑，四氫呋喃、無水乙醇和乙醚等均為國產分析純試劑，試驗用水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim －pack CLC －C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，Shim －pack CLC －C18保護柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －乙醇 － 四氫呋喃 － 水(57∶10∶8∶25);流速:1.1 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:248 nm;靈敏度:1.00 AUFS;進樣量:20 μL。

2.2 溶液配制

丙戊酸對照品溶液:精密稱取58.4 mg丙戊酸鈉對照品，置25 mL容量瓶中，用0.2 moL/L氨水溶解并定容，得到2.01 g/L的丙戊酸貯備液，置冰箱4℃保存，臨用時用水稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。

內標溶液:精密稱取環己烷羧酸26.3 mg，置25 mL量瓶中，用0.2 moL/L的氨水稀釋至刻度，再取該液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得0.1g/L的內標溶液。

衍生化試液:稱取α－溴苯乙酮63.8mg，置25mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得2.5 g/L的衍生化試液，密封、冷藏保存。

堿化液:氫氧化鈉 20.8 g，加水溶解，定容至500 mL，再量取該氫氧化鈉溶液1.0 mL，加水5.0mL，加乙腈定容至 25.0 mL。

2.3 血樣處理

精密吸取血清 50 μL，加入內標溶液 50 μL，再加 3 moL/L硫酸 50 μL，混勻;加入乙醚 2 mL渦旋提取 1 min，離心 5 min(3500 r/min)，吸取上清液至離心管中，加入堿化液70 μL和2.5g/L α－溴苯乙酮溶液 100μL，漩渦混勻，在55℃水浴反應60 min，氮氣吹干，殘渣用 200 μL甲醇溶解，旋渦振蕩30 s。

2.4 方法學考察

專屬性試驗:在本試驗條件下，以5人份的混合空白血清、空白血清加對照品與內標、癲癇患兒服藥后的血清加內標，按2.3項下方法處理后測定，得色譜圖1。可見，丙戊酸衍生物與內標衍生物分離良好，血清中無明顯內源性雜質干擾峰，表明本方法有較強的專屬性。丙戊酸及內標的衍生物保留時間分別為4.38 min和6.55 min。

標準曲線繪制:將丙戊酸鈉貯備液用空白血清稀釋成質量濃度分別為 10.0，20.1，40.1，60.2，100.4，150.5，200.7 μg/mL，按2.3項下方法處理，進樣20 μL。以丙戊酸與內標衍生物峰面積之比(X)對丙戊質量酸濃度(Y)進行線性回歸(加權系數1/C2)，得回歸方程 Y=94.685 X －0.245，r=0.9998。結果表明，丙戊酸質量濃度在10～200 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。最低定量質量濃度為 2 μg/mL(n=6，RSD≤6.6%)。

回收率試驗:取空白血清0.05 mL，制備低、中、高3個質量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項下方法處理后測定6次，計算方法回收率。結果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 丙戊酸的回收率試驗結果(，n=6)

表1 丙戊酸的回收率試驗結果(，n=6)

加入量(μg/mL)10.060.2150.5測得量(μg/mL)10.00 ±0.1559.69 ±3.07155.54 ±2.66回收率(%)99.80 ± 1.5499.15 ± 5.10103.35 ± 1.77

精密度試驗:取空白血清0.05 mL，制備低、中、高3個質量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項處理后測定，1 d內測定6次，以及1周內測定6次，計算方法的精密度。結果見表2。

衍生物穩定性試驗:制備低、中、高3個質量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項下方法處理后室溫放置。以0時測定值為100%，分別在5，10 h時進樣測定。結果含量分別為(100.32±1.41)%和(100.70±2.51)%，表明丙戊酸衍生物在室溫放置10 h穩定。

表2 丙戊酸的精密度試驗結果(，n=6)

表2 丙戊酸的精密度試驗結果(，n=6)

加入量(μg/mL)日內精密度 日間精密度10.060.2150.5測得量(μg/mL)10.00 ± 0.1559.69 ± 3.07155.54 ± 2.66 RSD(%)1.545.141.71測得量(μg/mL)9.75 ± 1.5559.59 ± 2.96152.25 ± 4.34 RSD(%)1.594.972.85

2.5 臨床應用

32名服用丙戊酸鈉的癲癇患兒，年齡8個月～17歲，服藥劑量15～50 mg/(kg·d)，用本方法測定穩態谷濃度，結果在治療窗(50～100 μg/mL)之內16例，高于治療窗2例，其余低于治療窗濃度。結果表明，患兒在服用丙戊酸治療期間應經常監測血藥濃度，才能達到個體化合理治療的目的。

3 討論

文獻報道的HPLC法[3－6]多采用α－溴苯乙酮作衍生劑，用量100～200μg。本試驗表明，衍生劑用量為200μg、三乙胺為20μL時，對高質量濃度的丙戊酸血樣(200 μg/mL，血清用量為0.1 mL)，衍生程度只有82%左右，衍生化不完全，易導致測定誤差。當α－溴苯乙酮用量增加至反應物總量(包括丙戊酸和三乙胺)的6倍(摩爾倍數)時，衍生反應才較完全，產率達96%以上。但是，當α－溴苯乙酮用量增加至400 μg時，柱壓增加較快，易發生堵柱現象。

用三乙胺乙腈溶液作催化劑，α－溴苯乙酮用量在200μg以上時，反應產物雜質較多，基線到7.5 min后才能平穩，常常對環己羧酸內標峰有干擾。用氫氧化鈉乙腈溶液作催化劑，雜質少，基線3.5 min后就很平穩，克服了用三乙胺作催化劑的缺陷。

在甲醇、水組成的流動相中加入一定量的四氫呋喃和乙醇，可加快衍生物的洗脫，縮短分析周期。本研究中建立的高效液相色譜法具有線性范圍寬、簡便快速、靈敏準確等優點，適用于丙戊酸的常規血藥濃度監測和藥物動力學研究。

[1]宋戰義，陳慶麗.丙戊酸鈉規范化治療癲癇兒童的臨床研究[J].醫學理論與實踐，2010，23(4):411 －412.

[2]史昆鵬，李曉晶，李曉麗.丙戊酸鈉血藥濃度監測對指導兒童癲癇病治療的臨床意義[J].吉林醫學，2008，29(23):2201 －2202.

[3]李順煒，毛名揚，李國忠.改進的柱前衍生高效液相色譜法測定人血中丙戊酸鈉[J].中國醫院藥學雜志，2005，25(8):713－715.

[4]張志國，雷力力，李 冬，等.HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度的衍生化影響因素考察[J].中國藥房，2010，21(34):3204 －3206.

[5]展 翔，徐 玫.高效液相色譜法測定人血清中丙戊酸鈉含量[J].中國藥業，2009，18(6):25－26.

[6]周莉華，涂 瓊，梅步云.HPLC法測定人血清中丙戊酸鈉的濃度[J].中國藥房，2011，22(26):2441 －2442.

[7]Antunes MV，Nagel V，Linden R，et al.Determination of valproic acid in serum by high performance liquid chromatography with diode array detection(HPLC －DAD)，after derivatization with phenacyl bromide[J].Quim Nava，2009，32(5):1227－1230.