高效液相色譜法測定兔血漿中鹽酸氯胺酮質(zhì)量濃度＊

曹殿青 ，趙麗斌，呂應(yīng)年，魯應(yīng)軍，田 樂

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 湛江 524000; 2.廣東醫(yī)學(xué)院研究生院，廣東 湛江 524023;3.廣東醫(yī)學(xué)院天然藥物開發(fā)研究中心，廣東 湛江 524023)

氯胺酮為苯環(huán)己哌啶的衍生物，系一種新型的分離麻醉藥，起效快，作用時(shí)間短，是目前唯一具有鎮(zhèn)痛作用的靜脈全身麻醉藥，因其作用確切、呼吸影響小、咽喉保護(hù)性反射抑制輕微等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于小兒麻醉和輔助麻醉，但不良反應(yīng)較多，因此需明確了解其在體內(nèi)的血藥濃度，保證術(shù)中患者生命體征的平穩(wěn)。筆者在參考文獻(xiàn)[1]的基礎(chǔ)上，建立了具有操作簡便、快速準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測血漿中鹽酸氯胺酮質(zhì)量濃度的方法，為鹽酸氯胺酮臨床血藥濃度的監(jiān)測及毒理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)的研究提供幫助。

1 儀器與試藥

美國安捷倫1200型高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵及G1322AA在線脫氣機(jī)、1515B二極管陣列檢測器;HP1200色譜工作站;TDL－40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);AE240型電子天平(梅特勒－托利多上海有限公司);漩渦混合器。鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品、布比卡因標(biāo)準(zhǔn)品由上海瑞齊有限公司提供;乙腈、甲醇為色譜純(天津四友公司)，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇－乙腈－磷酸鹽緩沖液(50∶15∶35)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取鹽酸氯胺酮、布比卡因標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別用甲醇定容后配成兩種標(biāo)準(zhǔn)貯備液，質(zhì)量濃度分別為1 g/L和100 μg/mL的貯備液，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫们芭渲瞥刹煌|(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血樣處理

取新鮮全血2 mL，迅速加入含50IU肝素的試管中，4000 r/min離心10 min，精密吸取兔血漿1.0 mL至5 mL具塞玻璃試管，置冰箱備用。精密吸取0.2 mL含藥血漿至5 mL玻璃試管，加入內(nèi)標(biāo)液(100 μg/mL 布比卡因 50 μL)，2 mol/L NaOH 10 μL，渦旋30 s，再加入2mL乙酸乙酯萃取，渦旋30s，在振蕩器上振搖20 min，12000 r/min離心10 min，取有機(jī)相移入至另一潔凈管內(nèi)，氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃?dòng)相200 μL溶解，高效液相色譜儀中進(jìn)樣20 μL分析，重復(fù)3次。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性考察:取空白血漿、空白血漿+布比卡因、空白血漿+鹽酸氯胺酮、空白血漿+鹽酸氯胺酮+布比卡因，按照2.3項(xiàng)下方法測定，所得色譜圖見圖1。鹽酸氯胺酮和布比卡因的保留時(shí)間分別為5.018 min和8.161 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不影響鹽酸氯胺酮的測定。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:于空白兔血漿中加入不同質(zhì)量濃度的鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其血漿濃度分別為 0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，25 μg/mL，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。由色譜圖計(jì)算樣品峰面積 A樣和內(nèi)標(biāo)峰面積 a標(biāo)的比值 Y(Y=A樣/a標(biāo))，以 Y對血藥濃度 C(μg/mL)、用加權(quán)最小二乘法作回歸計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y=0.0421 C+0.012(R2=0.9995)。結(jié)果表明，鹽酸氯胺酮質(zhì)量濃度在0.25～25 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積比呈良好的線性關(guān)系，以信噪比值(S/N)不小于3確定的最低檢測濃度為0.1 μg/mL。

精密度試驗(yàn):于空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其血漿濃度分別為 0.5，2.5，25 μg/mL，按照 2.3 項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。取3種質(zhì)量濃度的供試液分別于第1日和第3日的 0:00，4:00，8:00，12:00，16:00，20:00 不同時(shí)間段測定 12次，記錄每次測得的質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果0.50，2.50，25.00 μg/mL血漿濃度下日內(nèi)、日間精密度 RSD 分別為3.46%，2.22%，3.53%和3.08%，4.90%，4.76%，表明儀器精密度良好。

回收率試驗(yàn):取鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為 0.5，2.5，25 μg/mL 的溶液，每種質(zhì)量濃度各 0.2 mL，加入內(nèi)標(biāo)液50 μL，混勻，氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃?dòng)相200 μL渦旋3 min，吸取20 μL經(jīng)高效液相色譜分析測定，得鹽酸氯胺酮峰面積 A1。于空白血漿中加入不同濃度的鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其血漿濃度分別為 0.5，2.5，25 μg/mL，按照 2.3 項(xiàng)下方法測定，得鹽酸氯胺酮峰面積 A2，根據(jù)方程計(jì)算鹽酸氯胺酮的測定濃度(C測)。提取回收率=(7×A2)/(5×A1)×100%，方法回收率=C測/C標(biāo)準(zhǔn)×100%。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸氯胺酮回收率試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn):于空白血漿中加入鹽酸氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成質(zhì)量濃度為 2.5 μg/mL 的溶液，按照 2.3 項(xiàng)下方法，取 0，3，6，12，24，36，48 h不同時(shí)點(diǎn)進(jìn)行測定，記錄每次測得的質(zhì)量濃度。結(jié)果的 RSD=4.46%(n=7)，表明溶液穩(wěn)定性良好。

3 討論

鹽酸氯胺酮為白色結(jié)晶性粉末，無臭，在水中易溶，在熱乙醇中溶解，在乙醚或苯中不溶[2]，熔點(diǎn)259～263℃，熔融同時(shí)分解。鹽酸氯胺酮的化學(xué)名為2－(2－氯苯基)－2－(甲氨基)環(huán)己酮鹽酸鹽，分子式為C13H16ClNO·HCl。本試驗(yàn)根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，先堿化血漿使其以分子形式存在，再用有機(jī)溶劑萃取，揮干后以醇重溶。

在萃取試驗(yàn)中，比較了堿化血漿與不堿化血漿的萃取率，并對堿化溶液的用量進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，用2 mol/L NaOH可使萃取率得到較大的提高。

在萃取溶劑的選擇上，分別對乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正己烷－異丙醇－二氯甲烷(64∶3∶33)5種萃取溶劑進(jìn)行考察[3－5]，發(fā)現(xiàn)用二氯甲烷進(jìn)行萃取時(shí)，由于萃取溶劑密度大，有機(jī)溶劑在血漿層下，操作時(shí)有機(jī)層不易被吸取出，影響鹽酸氯胺酮的萃取率;正己烷、正己烷－異丙醇－二氯甲烷(64∶3∶33)萃取時(shí)雜質(zhì)較多，且有機(jī)溶劑的配比不易精確，干擾樣品的測定;用乙醚和乙酸乙酯萃取時(shí)其回收率高、雜質(zhì)少，但乙醚的揮發(fā)性造成結(jié)果變動(dòng)較大。最終確定乙酸乙酯為萃取液。

對多種流動(dòng)相進(jìn)行了篩選分析，用甲醇與水的一定比例或加少量酸或加少量堿時(shí)，存在分析時(shí)間過長、雜質(zhì)峰干擾主峰等弊端;用 磷酸鹽緩沖鹽 (0.025 mol/L K2HPO4與 0.003 mol/L KH2PO4等量混合)－甲醇(35∶65)時(shí)[5]，峰形欠佳，存在拖尾現(xiàn)象;而用磷酸鹽緩沖鹽 (0.02 mol/L K2HPO4與0.02 mol/L KH2PO4以2.5∶1混合)－甲醇 －乙腈(50∶15∶35)時(shí)，雜質(zhì)對測定無干擾，各組分的分離度和峰形都較好，且分離周期短。因此，采用最后一種方案作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

本試驗(yàn)所建立的高效液相色譜法操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、方法可靠、專屬性理想、穩(wěn)定性好，適合臨床用于進(jìn)行鹽酸氯胺酮的藥動(dòng)學(xué)研究。

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