高效液相色譜熒光法測定人血漿中順式阿曲庫銨濃度

王述蓉，江啟蓉，馮碧敏

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000)

順式阿曲庫銨(cis－atracurium)是一種新型中時(shí)效非去極化肌松藥，是構(gòu)成阿曲庫銨消旋混合物的10種同分異構(gòu)體之一，其肌松效應(yīng)和代謝方式與阿曲庫銨相似，但肌松強(qiáng)度約為阿曲庫銨的3倍。該藥起效、恢復(fù)快，無蓄積作用，不釋放組胺，對(duì)心血管系統(tǒng)影響輕，代謝不依賴肝腎功能以及代謝產(chǎn)物無肌松作用，是目前較理想的肌松藥，尤其適用于高齡、肝腎功能不全、心血管疾病以及重癥監(jiān)護(hù)病房患者[1]。目前測定人血漿中順式阿曲庫銨質(zhì)量濃度的方法主要有高效液相色譜熒光法(HPLC－FLU)[2]和高效液相色譜質(zhì)譜法(LC－MS)[3]，后者靈敏度雖高，但儀器昂貴，分析成本較高。本試驗(yàn)中利用乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，操作簡單、靈敏、準(zhǔn)確，適用于順式阿曲庫銨臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括510型恒流泵、2475熒光檢測器、Milliennium2010色譜工作站;AE240型電子天平(Mettler公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。順式苯磺酸阿曲庫銨對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為48090107RS);空白人血漿(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科);乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Diamonsil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);激發(fā)波長:230 nm，發(fā)射波長:324 nm;柱溫:40℃;流動(dòng)相:0.04 mol/L磷酸二氫鉀(pH=3.0)－ 乙腈(60 ∶40);流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。在上述色譜條件下，被測藥物與各雜峰分離良好，順式阿曲庫銨的保留時(shí)間為9.4 min(見圖1)。

2.2 溶液制備

精密稱取順式阿曲庫銨對(duì)照品適量，用pH=3.0的硫酸溶液配制成1 g/L的對(duì)照品貯備液，置4℃冰箱避光保存。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 樣品處理

精密量取血漿樣品0.5 mL，加入 pH=3.0的硫酸溶液50 μL，混勻，再加入乙腈 1 mL，渦混 2 min，15000 r/min離心 10 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用空白血漿分別配制質(zhì)量濃度為10，20，50，100，250，1250，2500 ng/L 的順式阿曲庫銨血漿標(biāo)準(zhǔn)系列液。按2.3項(xiàng)下方法處理，測定血漿中順式阿曲庫銨質(zhì)量濃度。以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得線性方程 A=7.234C+0.302，r=0.9990(n=7)。結(jié)果表明，順式阿曲庫銨進(jìn)樣質(zhì)量濃度在10.0～2500 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。檢測限和定量限分別為2.5 ng/mL和10 ng/mL。

精密度試驗(yàn):用空白血漿分別配制質(zhì)量濃度為20，100，1250 ng/mL的順式阿曲庫銨質(zhì)控樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理，測定順式阿曲庫銨濃度。對(duì)3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度考察，結(jié)果見表1。

回收率試驗(yàn):將所測定高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得質(zhì)量濃度，以真實(shí)血樣質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)，將兩組質(zhì)量濃度相比，計(jì)算順式阿曲庫銨方法回收率;另以流動(dòng)相配制相應(yīng)系列質(zhì)量濃度的順式阿曲庫銨溶液，直接測定，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將兩組峰面積相比，計(jì)算順式阿曲庫銨提取回收率。結(jié)果見表2。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

穩(wěn)定性試驗(yàn):取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(20，100，1250 ng/mL)的質(zhì)控樣品若干份，進(jìn)行血漿樣品凍存、多次凍融、樣品處理后室溫放置及4℃冷藏放置的考察。樣品在－20℃保存2周、連續(xù)凍融3次、樣品處理后室溫保存12 h和樣品處理后于4℃保存24 h的情況下，血漿中順式阿曲庫按的回收率均在95%以上，RSD＜4.0%，表明穩(wěn)定性良好。

3 討論

分別對(duì)200 nm、230 nm和280 nm 3個(gè)激發(fā)波長進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)順式阿曲庫銨保留時(shí)間基本相似，但在激發(fā)波長230 nm時(shí)順式阿曲庫銨的峰面積最大，峰形最好，因此選擇230 nm作為熒光的激發(fā)波長。順式阿曲庫銨結(jié)構(gòu)中含有酯鍵和季銨基團(tuán)，因此本品易水解，且對(duì)高溫不穩(wěn)定，故在處理中需用硫酸酸化血漿樣品以減少其分解。在流動(dòng)相中加入磷酸鹽緩沖液較好地改善了順式阿曲庫銨的峰形，當(dāng)流動(dòng)相組成為0.04 mol/L磷酸二氫鉀(pH 3.0)－乙腈(60∶40)時(shí)，分離效果較好。綜上所述，本試驗(yàn)利用乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，適用于人血漿中順式阿曲庫銨濃度的測定和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究。

[1]Owens CA，Brakoniecki J.Cisatracurium:a new nondepolarizing neuromuscular blocking agent[J].Conn Med，1996，60(8):461－463.

[2]Imbeault K，Withington DE，Varin F.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a 0.1 mg/kg dose of cisatracurium besylate in children during N2O/O2/propofol anesthesia[J].Anesth Analg，2006，102(3):738－743.

[3]Wang P，Zhang H，Stewart JT，et al.Simultaneous detection of cisatracurium，its degradation products and propofol using positive ion detection followed by negative ion detection in a single LC/MS run[J].J Pharm Biomed Anal，1998，17(3):547－553.