高效液相色譜熒光法測定人血漿中順式阿曲庫銨濃度

王述蓉，江啟蓉，馮碧敏

(瀘州醫學院附屬醫院藥劑科，四川 瀘州 646000)

順式阿曲庫銨(cis－atracurium)是一種新型中時效非去極化肌松藥，是構成阿曲庫銨消旋混合物的10種同分異構體之一，其肌松效應和代謝方式與阿曲庫銨相似，但肌松強度約為阿曲庫銨的3倍。該藥起效、恢復快，無蓄積作用，不釋放組胺，對心血管系統影響輕，代謝不依賴肝腎功能以及代謝產物無肌松作用，是目前較理想的肌松藥，尤其適用于高齡、肝腎功能不全、心血管疾病以及重癥監護病房患者[1]。目前測定人血漿中順式阿曲庫銨質量濃度的方法主要有高效液相色譜熒光法(HPLC－FLU)[2]和高效液相色譜質譜法(LC－MS)[3]，后者靈敏度雖高，但儀器昂貴，分析成本較高。本試驗中利用乙腈沉淀蛋白后直接進樣，操作簡單、靈敏、準確，適用于順式阿曲庫銨臨床藥物代謝動力學的研究。現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括510型恒流泵、2475熒光檢測器、Milliennium2010色譜工作站;AE240型電子天平(Mettler公司);AS10200型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。順式苯磺酸阿曲庫銨對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為48090107RS);空白人血漿(瀘州醫學院附屬醫院輸血科);乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Diamonsil C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);激發波長:230 nm，發射波長:324 nm;柱溫:40℃;流動相:0.04 mol/L磷酸二氫鉀(pH=3.0)－ 乙腈(60 ∶40);流速:0.5 mL/min;進樣量:20 μL。在上述色譜條件下，被測藥物與各雜峰分離良好，順式阿曲庫銨的保留時間為9.4 min(見圖1)。

2.2 溶液制備

精密稱取順式阿曲庫銨對照品適量，用pH=3.0的硫酸溶液配制成1 g/L的對照品貯備液，置4℃冰箱避光保存。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 樣品處理

精密量取血漿樣品0.5 mL，加入 pH=3.0的硫酸溶液50 μL，混勻，再加入乙腈 1 mL，渦混 2 min，15000 r/min離心 10 min，取上清液10 μL進樣分析。

2.4 方法學考察

標準曲線繪制:用空白血漿分別配制質量濃度為10，20，50，100，250，1250，2500 ng/L 的順式阿曲庫銨血漿標準系列液。按2.3項下方法處理，測定血漿中順式阿曲庫銨質量濃度。以質量濃度(C)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標，采用加權最小二乘法進行線性回歸，得線性方程 A=7.234C+0.302，r=0.9990(n=7)。結果表明，順式阿曲庫銨進樣質量濃度在10.0～2500 ng/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。檢測限和定量限分別為2.5 ng/mL和10 ng/mL。

精密度試驗:用空白血漿分別配制質量濃度為20，100，1250 ng/mL的順式阿曲庫銨質控樣品，按2.3項下方法處理，測定順式阿曲庫銨濃度。對3個質量濃度的質控樣品進行日內和日間精密度考察，結果見表1。

回收率試驗:將所測定高、中、低3個質量濃度的質控樣品的峰面積帶入標準曲線，計算所得質量濃度，以真實血樣質量濃度為標準，將兩組質量濃度相比，計算順式阿曲庫銨方法回收率;另以流動相配制相應系列質量濃度的順式阿曲庫銨溶液，直接測定，以此為標準，將兩組峰面積相比，計算順式阿曲庫銨提取回收率。結果見表2。

表1 精密度試驗結果

表2 回收率試驗結果(n=5)

穩定性試驗:取低、中、高3個質量濃度(20，100，1250 ng/mL)的質控樣品若干份，進行血漿樣品凍存、多次凍融、樣品處理后室溫放置及4℃冷藏放置的考察。樣品在－20℃保存2周、連續凍融3次、樣品處理后室溫保存12 h和樣品處理后于4℃保存24 h的情況下，血漿中順式阿曲庫按的回收率均在95%以上，RSD＜4.0%，表明穩定性良好。

3 討論

分別對200 nm、230 nm和280 nm 3個激發波長進行了比較，發現順式阿曲庫銨保留時間基本相似，但在激發波長230 nm時順式阿曲庫銨的峰面積最大，峰形最好，因此選擇230 nm作為熒光的激發波長。順式阿曲庫銨結構中含有酯鍵和季銨基團，因此本品易水解，且對高溫不穩定，故在處理中需用硫酸酸化血漿樣品以減少其分解。在流動相中加入磷酸鹽緩沖液較好地改善了順式阿曲庫銨的峰形，當流動相組成為0.04 mol/L磷酸二氫鉀(pH 3.0)－乙腈(60∶40)時，分離效果較好。綜上所述，本試驗利用乙腈沉淀蛋白后直接進樣，方法簡單、靈敏、準確，適用于人血漿中順式阿曲庫銨濃度的測定和藥物代謝動力學的研究。

[1]Owens CA，Brakoniecki J.Cisatracurium:a new nondepolarizing neuromuscular blocking agent[J].Conn Med，1996，60(8):461－463.

[2]Imbeault K，Withington DE，Varin F.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a 0.1 mg/kg dose of cisatracurium besylate in children during N2O/O2/propofol anesthesia[J].Anesth Analg，2006，102(3):738－743.

[3]Wang P，Zhang H，Stewart JT，et al.Simultaneous detection of cisatracurium，its degradation products and propofol using positive ion detection followed by negative ion detection in a single LC/MS run[J].J Pharm Biomed Anal，1998，17(3):547－553.