反相高效液相色譜法測定心可舒顆粒中葛根素和蘆丁含量

陽 華，王文淵，蔣小玲

(1.湖南省永州市藥品檢驗所，湖南 永州 425600; 2.湖南永州職業技術學院，湖南 永州 425600;3.湖南恒偉藥業有限公司，湖南 永州 425000)

心可舒顆粒是以山楂、丹參、葛根、三七、木香5味中藥為原料制成的顆粒制劑，具有活血化瘀、行氣止痛的功效，用于氣滯血瘀型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病引起的胸悶、心絞痛、高血壓、頭暈、頭痛、頸項疼痛及心律失常、高血脂等癥的治療。山楂、丹參為方中主藥，其所含黃酮成分同樣具有擴張血管、增加血流量[1－2]、降低心肌耗氧量、降低血清膽固醇、抗動脈硬化、抗心絞痛作用[3－5]，具有防治心血管疾病的功能[6]，測定方法使用可見－紫外分光光度法。但現行使用的心可舒顆粒質量標準僅以測定葛根素的含量來控制質量[7]，而未對其他兩味君藥進行質量評價。筆者采用反相高效液相色譜法同時測定葛根素和蘆丁的含量，以蘆丁為對照計算總黃酮[8－9]，可控制產品中山楂、丹參、葛根3味主藥材的質量，進一步完善和提高了該制劑的質量標準。

1 儀器與試藥

Waters 600E泵高效液相色譜儀，Waters PAD996二極管陣列檢測器;Waters M32色譜工作站;Mettler AE240型天平(梅特勒－托利多上海儀器有限公司);KS－600D型超聲清洗器(寧波科生儀器廠)。葛根素對照品(批號為110736－200527)、蘆丁對照品(批號為07773－9910)均購自中國藥品生物制品檢定所;心可舒顆粒(湖南恒偉藥業有限公司，批號分別為090813，091101，091008);甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Symmetry C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:0.8 mL/min;檢測波長:252 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;流動相:甲醇－水－乙腈－冰醋酸(28∶60∶10∶2)。在上述色譜條件下，葛根素和蘆丁的理論板數分別大于5000和4000，葛根素和蘆丁與其相鄰峰分離良好，譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h的葛根素對照品12.7 mg，蘆丁對照品 9.85 mg，置 50 mL 量瓶中，用 70% 甲醇溶解定容至刻度，制成含葛根素0.254 g/L、蘆丁0.197 g/L的混合對照品溶液。取裝量差異項下的樣品，研細，精密稱取0.5 g，置具塞三角瓶中，加70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，取出，放冷至室溫，再次稱定，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密取續濾液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例稱取除山楂、丹參的其他藥味，依照心可舒顆粒的制備工藝制成缺山楂、丹參的心可舒陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密量取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 50 mL 棕色量瓶中，用 70% 甲醇釋至刻度，搖勻，制成葛根素和蘆丁的系列混合標準溶液。分別精密吸取上述溶液10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積 Y為縱坐標、質量濃度 X為橫坐標繪制標準曲線。葛根素的回歸方程為 Y=4837.174X+157.92，r=0.9998(n=6)，表明葛根素質量濃度在2.54～25.4 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好;蘆丁的回歸方程為 Y=3228.516X －71.86，r=0.9996(n=6)，表明蘆丁質量濃度在1.97～19.7 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定色譜峰面積。結果葛根素、蘆丁峰面積積分值的 RSD分別為1.85%和2.04%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，照2.1項下色譜條件分別于配制后 0，2，4，6，8，10 h 時進樣。結果葛根素、蘆丁峰面積積分值的 RSD分別為1.29%和 1.54%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內穩定。

重復性試驗:取6份同一批(批號為091004)樣品粉末0.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制成6份供試品溶液，按2.4項下操作。結果葛根素和蘆丁含量的平均值分別為16.57 mg/g和5.74 mg/g，RSD 分別為 1.17%和 1.69%(n=6)。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的本品3組，每組2份，3組分別精密加入一定量的葛根素和蘆丁對照品，按供試品溶液制備方法制備及色譜條件進行測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取不同批次的樣品，按供試品溶液制備方法制備所需供試品溶液;精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，測定峰面積，用外標法計算樣品中葛根素、蘆丁的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

在采用超聲提取有效成分時，考察了不同提取時間(20，30，40，50 min)對測定結果的影響。結果表明，超聲40 min已能將樣品中的有效成分提取完全，因此選擇超聲提取40 min。若以流動相為稀釋劑，色譜顯示主成分峰與雜質峰不能完全分離，影響定量分析結果，故選用甲醇為稀釋劑。

各取葛根素和蘆丁對照品適量，初始流動相溶解配成溶液，在200～400 nm波長范圍進行掃描，發現葛根素在195，252，305 nm處有吸收峰。蘆丁在254，347 nm處有吸收峰，在252 nm處也有較強吸收，故選擇252 nm作為檢測波長。

在對流動相乙腈－水、甲醇－水、甲醇－水－乙睛、甲醇－水－乙睛－冰醋酸的組成及比例進行的反復試驗比較中發現，以甲醇－水－乙睛－冰醋酸(28∶60∶10∶2)作流動相，分離效果較好，得到色譜圖的峰形較好。所建立的方法重現性好，測定結果準確，為產品的質量控制提供了新的依據。

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