反相高效液相色譜法測定心可舒顆粒中葛根素和蘆丁含量

陽 華，王文淵，蔣小玲

(1.湖南省永州市藥品檢驗(yàn)所，湖南 永州 425600; 2.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425600;3.湖南恒偉藥業(yè)有限公司，湖南 永州 425000)

心可舒顆粒是以山楂、丹參、葛根、三七、木香5味中藥為原料制成的顆粒制劑，具有活血化瘀、行氣止痛的功效，用于氣滯血瘀型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病引起的胸悶、心絞痛、高血壓、頭暈、頭痛、頸項(xiàng)疼痛及心律失常、高血脂等癥的治療。山楂、丹參為方中主藥，其所含黃酮成分同樣具有擴(kuò)張血管、增加血流量[1－2]、降低心肌耗氧量、降低血清膽固醇、抗動(dòng)脈硬化、抗心絞痛作用[3－5]，具有防治心血管疾病的功能[6]，測定方法使用可見－紫外分光光度法。但現(xiàn)行使用的心可舒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以測定葛根素的含量來控制質(zhì)量[7]，而未對(duì)其他兩味君藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。筆者采用反相高效液相色譜法同時(shí)測定葛根素和蘆丁的含量，以蘆丁為對(duì)照計(jì)算總黃酮[8－9]，可控制產(chǎn)品中山楂、丹參、葛根3味主藥材的質(zhì)量，進(jìn)一步完善和提高了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

Waters 600E泵高效液相色譜儀，Waters PAD996二極管陣列檢測器;Waters M32色譜工作站;Mettler AE240型天平(梅特勒－托利多上海儀器有限公司);KS－600D型超聲清洗器(寧波科生儀器廠)。葛根素對(duì)照品(批號(hào)為110736－200527)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)為07773－9910)均購自中國藥品生物制品檢定所;心可舒顆粒(湖南恒偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為090813，091101，091008);甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Symmetry C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:0.8 mL/min;檢測波長:252 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:甲醇－水－乙腈－冰醋酸(28∶60∶10∶2)。在上述色譜條件下，葛根素和蘆丁的理論板數(shù)分別大于5000和4000，葛根素和蘆丁與其相鄰峰分離良好，譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的葛根素對(duì)照品12.7 mg，蘆丁對(duì)照品 9.85 mg，置 50 mL 量瓶中，用 70% 甲醇溶解定容至刻度，制成含葛根素0.254 g/L、蘆丁0.197 g/L的混合對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置具塞三角瓶中，加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，取出，放冷至室溫，再次稱定，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例稱取除山楂、丹參的其他藥味，依照心可舒顆粒的制備工藝制成缺山楂、丹參的心可舒陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 50 mL 棕色量瓶中，用 70% 甲醇釋至刻度，搖勻，制成葛根素和蘆丁的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積 Y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度 X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葛根素的回歸方程為 Y=4837.174X+157.92，r=0.9998(n=6)，表明葛根素質(zhì)量濃度在2.54～25.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好;蘆丁的回歸方程為 Y=3228.516X －71.86，r=0.9996(n=6)，表明蘆丁質(zhì)量濃度在1.97～19.7 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定色譜峰面積。結(jié)果葛根素、蘆丁峰面積積分值的 RSD分別為1.85%和2.04%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件分別于配制后 0，2，4，6，8，10 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果葛根素、蘆丁峰面積積分值的 RSD分別為1.29%和 1.54%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取6份同一批(批號(hào)為091004)樣品粉末0.5 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按2.4項(xiàng)下操作。結(jié)果葛根素和蘆丁含量的平均值分別為16.57 mg/g和5.74 mg/g，RSD 分別為 1.17%和 1.69%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的本品3組，每組2份，3組分別精密加入一定量的葛根素和蘆丁對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備及色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取不同批次的樣品，按供試品溶液制備方法制備所需供試品溶液;精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中葛根素、蘆丁的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

在采用超聲提取有效成分時(shí)，考察了不同提取時(shí)間(20，30，40，50 min)對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，超聲40 min已能將樣品中的有效成分提取完全，因此選擇超聲提取40 min。若以流動(dòng)相為稀釋劑，色譜顯示主成分峰與雜質(zhì)峰不能完全分離，影響定量分析結(jié)果，故選用甲醇為稀釋劑。

各取葛根素和蘆丁對(duì)照品適量，初始流動(dòng)相溶解配成溶液，在200～400 nm波長范圍進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)葛根素在195，252，305 nm處有吸收峰。蘆丁在254，347 nm處有吸收峰，在252 nm處也有較強(qiáng)吸收，故選擇252 nm作為檢測波長。

在對(duì)流動(dòng)相乙腈－水、甲醇－水、甲醇－水－乙睛、甲醇－水－乙睛－冰醋酸的組成及比例進(jìn)行的反復(fù)試驗(yàn)比較中發(fā)現(xiàn)，以甲醇－水－乙睛－冰醋酸(28∶60∶10∶2)作流動(dòng)相，分離效果較好，得到色譜圖的峰形較好。所建立的方法重現(xiàn)性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了新的依據(jù)。

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