高效液相色譜法測定翁瀝通膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

陳 平，莫炫永

(1.東莞東華醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523110; 2.廣東省東莞市國藥質(zhì)量檢測中心，廣東 東莞 523010)

翁瀝通膠囊由黃芪、金銀花、梔子、薏苡仁、大黃、川木通等11味藥組方，具有清熱利濕、散結(jié)祛瘀功效，臨床用于證屬濕熱蘊結(jié)、痰瘀交阻之前列腺增生癥，癥見尿急或尿細、排尿困難等。黃芪具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效，而文獻[1－2]未見有測定黃芪的報道。因為黃芪甲苷在紫外沒有吸收，故參考文獻[3－7]采用高效液相色譜(HPLC)法，對翁瀝通膠囊中黃芪的有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量進行了研究，旨在為生產(chǎn)及流通控制產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 RRLC型高分離度快速液相色譜儀，包括G1314B VWD SL紫外檢測器，G1312B Bin Pump SL二元泵，G1316BTCC SL柱溫箱，G1329B ALS SL標(biāo)準(zhǔn)自動進樣器(美國安捷倫科技有限公司);KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(德國 Sartorius公司，型號為BP211D，CP224S)。毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為111920－201001);黃芪對照藥材(蒙古黃芪，中國藥品生物制品檢定所，批號為110781－200613);乙腈、甲醇 (德國默克集團Merck KGaA)為色譜純;水(屈臣氏蒸餾水，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾);翁瀝通膠囊(吉林省華威藥業(yè)有限公司，批號分別為110603，110721，110901)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Waters XTERRA MS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈 －1.5% 磷 酸(20 ∶80);流速:1.0 mL/min(流動相在使用前需經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾);檢測波長:260 nm;進樣量:10 μL;柱溫:30℃。以保留時間定性，峰面積定量。理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計可達3500以上;樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰與其他峰能達到基線分離，毛蕊異黃酮葡萄糖苷保留時間為7.19 min。分別精密吸取對照品溶液、黃芪對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL按色譜條件進樣。結(jié)果在7.28 min處陰性對照品溶液無毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰，供試品溶液與黃芪對照藥材溶液比較在 3.20，4.07，7.19，10.56 min 處有共有峰。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品15.11 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為302.2 mg/L的對照品溶液。精密稱取黃芪對照藥材0.3056 g，置5 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇適量超聲20 min并稀釋至刻度，搖勻，即得黃芪對照藥材溶液。精密量取樣品2.3483 g，置25 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇適量超聲20 min并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照處方及生產(chǎn)工藝制備不含黃芪的陰性樣品適量，按供試品溶液方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系試驗:精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品15.11mg，置50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為302.2 mg/L的對照品貯備溶液，分別用70%甲醇稀釋制成 7.55，15.11，30.22，60.44，90.66，151.1 mg/L的系列溶液。分別精密吸取10 μL按擬訂的色譜條件進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為 A=312526 C+20561，r=0.9992(n=6)。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度的線性范圍為7.55～151.1 mg/L。

精密度試驗:吸取質(zhì)量濃度為90.66 mg/L的對照溶液10 μL，依法重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.53%(n=6)。

重復(fù)性試驗:精密稱取同一樣品6份，各2.3 g，按供試品溶液制備方法操作，在擬訂的色譜條件下進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 為 0.89%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:吸取同一供試品溶液，在室溫下放置，分別于0，2，4，8，12，24 h 時進樣分析。結(jié)果含量的 RSD 為 1.32%(n=6)表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品適量共9份，分別加入80%，100%，120%3種量級的對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法操作，在擬訂的色譜條件下進樣分析。結(jié)果見表1。

表1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取樣品3批，按供試品溶液制備方法操作進樣分析，計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

本試驗選擇了乙腈－1.5%磷 酸、乙腈－水、甲醇－水、乙腈 －甲醇－水等流動相系統(tǒng)，其中乙腈 －1.5%磷酸(20∶80)系統(tǒng)的樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷與其他峰分離較好，且重現(xiàn)性較好，故選擇乙腈 －1.5%磷酸(20∶80)為流動相。

在供試品溶液制備時，對提取溶劑比較了純甲醇、不同百分比的甲醇、無水乙醇及文獻[6]的方法，對提取方法則比較了超聲提取、回流提取及索氏提取器提取，時間分別為10，20，30 min，結(jié)果以70%甲醇適量超聲20 min提取較完全且耗時短。

分別選取了230，254，260，285 nm波長進行試驗，最終選取260 nm作為測定波長，樣品干擾峰較少，基線平穩(wěn)。根據(jù)樣品含量測定結(jié)果，建議對產(chǎn)品評價時含量為每粒中含黃芪按毛蕊異黃酮葡萄糖苷計不得低于0.08 mg。

[1]肖 儉，趙子劍.高效液相色譜法測定翁瀝通片中綠原酸的含量[J].中南藥學(xué)，2010，8(4):319－320.

[2]張珉娜，王 冕.原子吸收分光光度法測定翁瀝通膠囊中銅含量[J].藥物分析雜志，2008，28(10):1755－1756.

[3]羅春霞，林平川，谷麗華，等.高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮－7－O－β－D－葡萄吡喃糖苷的含量[J].中國中藥雜志，2003，28(7):603－606.

[4]紀(jì)松崗，李 翔，婁子洋，等.高效液相色譜法測定黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花素的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27(1):81－83.

[5]石子儀，鮑 忠，姜 勇，等.不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J].中國中藥雜志，2007，32(9):779－783.

[6]饒偉文，王寶琴.黃芪類中藥中芒柄花素和毛蕊異黃酮的HPLC測定[J].中成藥，1991，13(9):32 －33.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:283－284.