除濕止癢洗液微生物限度檢查法的驗證

孟麗麗 ，陸 娟 ，肖 靜

(1.湖北省醫藥學院附屬醫院·襄陽市第一人民醫院，湖北 襄樊 441000;2.湖北省襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄樊 441000)

除濕止癢洗液是由蛇床子、黃連、黃柏、白鮮皮、苦參、虎杖、紫花地丁、地膚子、萹蓄、茵陳、蒼術、花椒、冰片等組成的復方洗劑，具有清熱除濕、祛風止癢的作用，可用于急性、亞急性濕疹證屬濕熱或濕阻型的輔助治療。筆者根據2010年版《中國藥典(一部)》附錄中對微生物限度檢查法驗證的要求[1]，采用常規法、培養基稀釋法及薄膜過濾法對其進行微生物限度檢查法的驗證，現將結果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

立式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司);HTY－2000B型集菌儀，集菌培養器(杭州泰林公司);PXY－120型電熱恒溫干燥箱(連云港千櫻醫療設備有限公司);LRH－250－A生化培養箱(廣東醫療器械廠);生物安全柜(蘇凈安泰公司)。除濕止癢洗液(四川通園制藥公司，批號為110403，110404，110410，規格為200 mL)。

1.2 菌種與培養基

大腸埃希菌[CMCC(B)44102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104];營養瓊脂，玫瑰瓊脂，營養肉湯，改良馬丁培養基，膽鹽乳糖培養基。以上菌種與培養基均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 稀釋劑與沖洗液

滅菌的0.05%聚山梨酯80－氯化鈉蛋白胨緩沖液;0.9%滅菌氯化鈉溶液;pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。

2 方法與結果

2.1 計數方法驗證

2.1.1 菌液及供試液制備

菌液制備:接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁斜面培養基上，23～28℃培養 5～7 d，加入 5 mL含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管中，用含0.05%(V/V)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL含孢子數為50～100 cfu的孢子懸液。

供試液制備:取供試品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液90 mL混勻，制成1∶10的供試液[2]。

2.1.2 試驗組

常規法:取1 mL供試液和1 mL試驗菌液分別注入平皿，立即傾入相應瓊脂培養基，搖勻，待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數。每株試驗菌平行制備5個平皿。

培養基稀釋法:取0.2 mL供試液和1 mL試驗菌液分別注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻，待凝固后按規定條件培養，每日觀察計算菌落數，每種試驗菌平行制備5個平皿。

薄膜過濾法:取1 mL供試液，置薄膜過濾器中過濾，用pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 mL，沖洗2次。在最后1次沖洗液中加入1 mL試驗菌液，取出濾膜菌膜朝上貼在相應培養基上按規定條件培養，每日觀察，計算菌落數。

2.1.3 菌液組

取上述試驗菌液按平皿法測定每1株菌株所加的試驗菌數。

2.1.4 供試品對照組

常規法:取1 mL供試液注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻，待凝固后按規定條件培養，每日觀察，計算菌落數，測定供試品本底菌數。

培養基稀釋法:取0.2 mL供試液注入平皿，立即傾入相應培養基，搖勻，待凝固后按規定條件培養，每日觀察，計算菌落數，每種試驗菌平行制備5個平皿。

薄膜過濾法:取1 mL供試液，置薄膜過濾器中過濾，用pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 mL，沖洗2次。取出濾膜，菌膜朝上貼在相應培養基上規定條件培養，每日觀察，計算菌落數。

2.1.5 稀釋劑對照組

取1 mL稀釋液和1 mL試驗菌液分別注入平皿，立即傾入相應瓊脂培養基，搖勻，待凝固后按規定條件培養，每日觀察，計算菌落數。每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.1.6 結果判斷

在3次獨立的平行試驗中(供試品批號分別為110403，110404，110410，試驗次數分別標示為 1，2，3，考察不同批次供試品對試驗的重復性及穩定性)，稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%，常規法和培養基稀釋法試驗組的菌回收率均低于70% ，而薄膜過濾法試驗組的菌回收率高于70% ，符合2010年版《中國藥典(一部)》附錄中對微生物限度檢查法驗證的要求[1]。因此，可照該供試液制備方法和薄膜過濾法測定供試品的細菌、霉菌和酵母菌數，結果見表1。

表1 計數檢查回收率測定結果

2.2 控制菌檢查方法驗證

2.2.1 菌液及供試液制備

菌液制備:接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30～35℃培養18～24 h;用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL含菌數為10～100 cfu的菌懸液。

供試液制備:取供試品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液90 mL混勻，制成1∶10的供試液。

2.2.2 試驗組

常規法:取1∶10供試液10 mL，分別加入100 mL膽鹽乳糖培養基和營養肉湯培養基中。分別加入1 mL 10～100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌液和銅綠假單胞菌菌液，依藥典相應控制菌檢查法進行檢查。

薄膜過濾法:取1∶10供試液1 mL，置薄膜過濾器中過濾，用pH=7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗100 mL，在最后1次沖洗液中加入1 mL試驗菌液，取出濾膜在相應培養基培養，每日觀察，依照相應控制菌檢查法進行檢查。

2.2.3 陽性對照組

陽性對照組試驗方法同供試品的控制菌檢查方法，對照菌的加菌量為10～100 cfu。

2.2.4 陰性對照組

取稀釋液10 mL照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。

2.2.5 結果判斷

在3次獨立的平行試驗中(供試品批號為110403，110404，110410，試驗次數分別標示為1，2，3)，陰性菌對照組無菌生長，陽性對照組檢出相應的控制菌，常規法試驗組未檢出試驗菌，薄膜過濾組檢出試驗菌，因此可按薄膜過濾法進行供試品的控制菌檢查，結果見表2。

表2 控制菌回收率測定結果

3 討論

根據2010年版《中國藥典(一部)》附錄中對微生物限度檢查法驗證的規定，含抑菌成分的中成藥制劑必須消除供試液的抑菌活性，然后再進行微生物限度檢查。除濕止癢洗液中的黃連、黃柏等中藥材的有效成分均有較強的抑菌作用，筆者對該樣品微生物限度檢查進行驗證，結果表明，用常規法及培養基稀釋法檢查此類有抑菌作用的樣品微生物限度，結果的準確性將受到影響，需要先消除供試液的抑菌活性，再進行檢查。采取薄膜過濾法沖洗2次就能較好地排除干擾，因此除濕止癢洗液的微生物限度檢查采用薄膜過濾法是切實可行的。

另外，菌液制備好后，應在2 h內使用，如果試驗時間緊張，應將菌液保存在冰箱內冷藏，1 d內用完，否則菌液活菌數變化較大，試驗結果不準確。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄79.

[2]蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社，2007:303.