高效液相色譜法和非水電位滴定法測定注射用鹽酸賴氨酸含量的比較

成 丹 ，李健和 ，彭詞艷 ，曾小慧 ，3，易利丹

(1.湖南省湘鄉市人民醫院藥劑科，湖南 湘鄉 411400;2.中南大學湘雅二醫院藥學部，湖南 長沙 410011; 3.中南大學藥學院，湖南 長沙 410013)

賴氨酸是人體8種必需氨基酸之一，能促進人體發育、增強免疫功能，并有提高中樞神經組織功能的作用[1－2]。目前開發上市的注射制劑有鹽酸賴氨酸注射液、注射用鹽酸賴氨酸、鹽酸賴氨酸氯化鈉注射液、鹽酸賴氨酸葡萄糖注射液[3－7]，臨床上用于治療顱腦外傷、慢性腦組織缺血、缺氧性疾病的腦保護劑[8－10]。鑒于鹽酸賴氨酸本身無紫外吸收，亦不產生熒光，且注射用鹽酸賴氨酸系主藥鹽酸賴氨酸以注射用水加熱溶解并經針用活性炭脫色后直接凍干而成的制劑，制劑中無其他任何輔料。為此，參照2010年版《中國藥典(二部)》鹽酸賴氨酸原料藥建立了非水電位滴定法測定注射用鹽酸賴氨酸含量，并與柱前衍生化高效液相色譜法進行比較，現報道如下。

1 儀器與試藥

LC－10Avp型高效液相色譜儀(日本島津);SPD－10Avp型紫外檢測器;分析之星色譜工作站;FA1004N型電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)。鹽酸賴氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為160732－201008，含量為99.6%);鹽酸賴氨酸原料藥(晉州冀榮氨基酸有限公司，批號為20101005，含量為99.2%);注射用鹽酸賴氨酸(由中南大學湘雅二醫院藥學部提供，規格為 1.5 g/瓶，批號為 20110214，20110215，20110216);2，4－二硝基氟苯為衍生化試劑，甲醇、乙醇均為色譜純，水為重蒸餾水，碳酸氫鈉、醋酸鈉、冰醋酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 非水電位滴定法

2.1.1 測定方法確定

由于注射用鹽酸賴氨酸處方中未加任何輔料，故參考2010年版《中國藥典(二部)》鹽酸賴氨酸的含量測定方法，擬訂本品的測定方法為高氯酸滴定法。取裝量差異項下內容物約80 mg，精密稱定，加醋酸汞試液5 mL，振搖使溶解，加冰醋酸25 mL，照電位滴定法[2010年《中國藥典(二部)》附錄ⅦA]，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 mL高氯酸滴定液(0.1 mol/L)相當于 9.133 mg 的 C6H14N2O2·HCl。

2.1.2 方法學考察

空白干擾試驗:不加鹽酸賴氨酸，采用上述方法滴定，結果消耗高氯酸滴定液(0.1052 mol/L)0.02 mL。

精密度試驗:取鹽酸賴氨酸對照品約80 mg，共6份，精密稱定，按上述方法測定。結果平均含量為99.5%，RSD為0.33%。

回收率試驗:取鹽酸賴氨酸約64，80，96 mg，各3份，精密稱定，用上述方法滴定。結果見表1。

表1 非水電位滴定法測定鹽酸賴氨酸的回收率試驗結果(n=9)

重復性試驗:取同一批樣品，稱取6份裝量差異項下內容物約80 mg，精密稱定，用上述方法滴定。結果平均含量為99.7%，RSD為0.35%，表明方法重復性良好。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件

色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Phenomenex C18柱(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.05 mol/L 醋酸鈉和醋酸溶液(60 ∶40);流速:1.0 mL/min;檢測波長:360 nm，柱溫:40℃;進樣量:20 μL。理論板數按鹽酸賴氨酸峰計算應不低于1000。

2.2.2 溶液制備

稱取鹽酸賴氨酸對照品約15 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加蒸餾水適量，振搖使溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，加1%2，4－二硝基氟苯乙腈溶液2.5 mL和5%碳酸鈉溶液2.5 mL，搖勻，于80℃水浴反應20 min，放冷，加pH為7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。稱取注射用鹽酸賴氨酸約15 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加蒸餾水適量，振搖使溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按對照品溶液的制備法制備供試品溶液。精密吸取蒸餾水5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按對照品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

空白干擾試驗:分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相同保留時間有相應的峰，陰性對照品溶液無對應峰，無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:分別稱取鹽酸賴氨酸對照品約5，10，15，20，25 mg，精密稱定，依法制備對照品溶液，分別量取20 μL，注入液相色譜儀，以質量濃度 C對主峰面積 A進行線性回歸，得回歸方程 A=24135 C－13191，r=0.9995。結果表明，鹽酸賴氨酸質量濃度在2.0～10.0 μg/mL的范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取線性關系考察項下質量濃度為6.0 μg/mL的對照品溶液，精密量取20 μL連續進樣6次。結果主峰面積的平均值為131764，RSD為0.41%。

重復性試驗:取批號為20110215的樣品5份，各精密稱取15 mg，依法制備供試品溶液并測定，以外標法計算其標示百分含量。結果平均含量為100.9%，RSD為0.35%。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時取樣測定。結果主峰面積的平均值為131807，RSD為0.48%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

加樣回收試驗:取鹽酸賴氨酸約12，15，18 mg各3份，精密稱定，按含量測定方法進行測定，結果見表2。

表2 衍生化高效液相色譜法測定鹽酸賴氨酸的回收率試驗結果

2.3 樣品含量測定

分別采用非水滴定法和高效液相色譜法測定3批樣品的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(標示量的%)

3 討論

文獻報道鹽酸賴氨酸的含量測定方法有電位滴定法[11－12]、柱前衍生化高效液相色譜法[13－15]、陽離子交換色譜高效液相色譜法[6]、蒸發光散射檢測高效液相色譜法[7]、與茚三酮反應顯色后可見分光光度法[16]等。蒸發光散射檢測高效液相色譜法往往受設備條件限制，與茚三酮反應顯色后可見分光光度法誤差較大，故在參考上述相關文獻的基礎上，本試驗分別采用非水電位滴定法和柱前衍生化高效液相色譜法進行注射用鹽酸賴氨酸的含量測定，并對兩種方法測得的3批樣品含量進行比較，結果表明，兩者都可準確地用于本品的含量測定，測得3批樣品的含量基本一致，均可為該藥物的質量控制提供保證。但兩種方法各有優缺點，柱前衍生化高效液相色譜法專屬性強、靈敏度高、重復性好，但操作繁雜，衍生化反應所需試劑難得;非水電位滴定法測定其電位突躍明顯、易辨、精密度和重復性良好、操作簡便、成本低、結果準確，能夠滿足其質量控制，更適合于常規檢測。因此，采用非水電位滴定法測定本品含量。根據本品所用的測定方法及試驗測定結果，結合生產實際，并參照2010年版《中國藥典(二部)》對注射劑的一般規定要求，擬訂本品含量限度，含鹽酸賴氨酸(C6H14N2O2·HCl)應為標示量的 95.0% ～ 105.0%。

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