長春新堿固體脂質納米粒的制備工藝優化＊

夏愛曉，孫 淵，馬紅丹

(浙江省臺州醫院藥劑科，浙江 臺州 317000)

長春新堿(vincristin，VCR)用于治療急性淋巴細胞性白血病，療效較好[1]，但神經毒性大，且對光不穩定，臨床使用不便。靶向制劑可降低長春新堿的神經毒性，并提高其體外穩定性，從而提高療效，這將是今后新劑型的研究趨勢。固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)能將藥物包裹于類脂核中而使藥物穩定性增加，并可改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在骨髓、脾、肺和肝等組織器官中積蓄，從而提高藥物的治療指數，具有緩控釋、靶向、低毒等優點[2－3]。筆者在單因素考察的基礎上，采用L9(34)正交表設計試驗，優化處方組成和制備工藝，為開發長春新堿新型制劑提供試驗基礎。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，TU－1901型雙光束紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);N4 PLUS型納米粒度分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);日立H－7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司);AF100 Scotsman型制冷機(美國斯科茨曼公司);AL104型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);SB25－120超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);88－1型定時恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠);Soniprep 150型超聲細胞粉碎儀(英國SANYO公司);pHS－3C pH酸度計(上海雷磁公司)。硫酸長春新堿(海南長春花藥業有限公司，含量為97.7%);單硬脂酸甘油酯(上海華精生物高科技有限公司);硬脂酸(德國Cognis公司);大豆卵磷脂(杭州宏博生物工程有限公司);泊洛沙姆188(德國BASF公司);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 長春新堿含量測定(高效液相色譜法)

2.1.1 色譜條件[4]

色譜柱:Hypersil ODS2 C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －水 －三乙胺(140∶60∶1，磷酸調 pH至=7.0);流速:1.0 mL/min;檢測波長:297 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL。

2.1.2 方法學考察

標準曲線繪制:稱取長春新堿對照品1.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。精密量取5.0 mL置50 mL容量瓶中，用75%甲醇定容至刻度，得質量濃度為 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0 μg/mL 的對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積，以長春新堿質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=12274 C －2682.3，r=0.9999(n=7)。結果表明，長春新堿質量濃度在0.5～5.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

回收率試驗:精密量取空白固體脂質納米粒2.0 mL共3份，置10 mL容量瓶中，加入對照品溶液適量，用75%甲醇定容，超聲處理后，得質量濃度為 0.5，1.5，5.0 μg/mL 的溶液，濾過，取續濾液進樣測定，計算回收率。結果表明，低、中、高3種質量濃度溶液的回收率均在98% ～102%之間，平均 RSD為1.6%，說明方法準確度良好，符合方法學要求。

精密度試驗:取質量濃度為 1.0，2.0，5.0 μg/mL 的對照品溶液，分別于1 d內重復進樣5次和5 d內每天進樣1次。結果日內精密度的 RSD=1.18%，日間精密度的 RSD=1.38%。

2.2 包封率和載藥量測定[5]

精密吸取長春新堿固體脂質納米粒(VCR－SLN)1.0 mL，置處理過的透析袋中，兩端扎緊，置50.0 mL的重蒸水中，磁力攪拌2.5 h后，精密量取透析袋外液，測定其中游離藥物的含量 C1;另外精密吸取等量的VCR－SLN混懸液，75%甲醇定容至刻度，超聲時納米粒充分破碎，測定長春新堿含量 C2。包封率(EE，%)=(1－C1/C2)×100% ，載藥量(DL，%)=(EE% ×Wp)/W總×100%。其中，Wp為制劑中長春新堿的含量，W總為制劑中脂質材料和藥物的總質量。

2.3 單因素考察

2.3.1 載體材料篩選

精密稱取基質(單硬脂酸甘油酯或硬脂酸)200.0 mg，加熱溶于無水乙醇，得有機相;精密稱取大豆卵磷脂100.0 mg，制成水溶液，作為內水相，第1次超聲(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含表面活性劑1%泊洛沙姆188)，第2次超聲(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W復乳，通氮氣下超聲揮發有機溶劑。用超聲細胞破碎儀于冰浴條件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀釋水相(蒸餾水0～2℃)中，即得。冰箱保存，放置1周，留樣觀察其穩定性。結果以單硬脂酸甘油酯為載體材料時無沉淀現象，略帶藍色乳光;以硬脂酸為載體材料時出現沉淀現象，較混濁。故選擇單硬脂酸甘油酯作為載體。

2.3.2 乳化劑篩選

稱取單硬脂酸甘油酯200.0 mg，共3份，加熱溶于無水乙醇，得有機相，以處方量的大豆卵磷脂水溶液為內水相，第1次超聲(600 W，6 min)乳化，形成W/O初乳;加外水相(含不同種類乳化劑)，第2次超聲(600 W，3 min)乳化，形成W/O/W復乳，通氮氣下超聲揮發有機溶劑。用超聲細胞破碎儀于冰浴條件、7 AM振幅下破碎10 min，再加入到稀釋水相(蒸餾水0～2℃)中即得。冰箱保存，放置1周，留樣觀察其穩定性。結果以卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)為乳化劑時溶液較透明，略帶藍色乳光;以卵磷脂－泊洛沙姆188－Tween－80(1∶2∶1)為乳化劑時溶液略呈黃色，放冷后較混濁;以卵磷脂 －泊洛沙姆188－Tween－80(1∶1∶1)為乳化劑時溶液略呈黃色，出現少許沉淀，較混濁。因此，選卵磷脂－泊洛沙姆188(1∶2)為乳化劑。

2.3.3 制備方法篩選[5－8]

熱熔超聲法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL無水乙醇，得有機相，75℃水浴;將水相加熱到與有機相相同溫度時注入有機相中，恒溫攪拌，制得初乳;趁熱將初乳超聲，冰水浴冷卻、固化2 h，過膜，即得。高溫乳化－低溫固化法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯溶于5.0 mL無水乙醇，得有機相;有機相和水相分別水浴加熱至 (75±5)℃，在有機相完全溶解為澄明液體后，攪拌(1000 r/min)下將其傾入水相中，恒溫攪拌2 h，使體積揮發至原來的1/3，得初乳;將初乳傾入20.0 mL的1%泊洛沙姆188中，繼續攪拌1 h，過膜，即得。

溶劑乳化－超聲法:精密稱取處方量泊洛沙姆188和Tween－80，置20.0 mL水中，超聲分散均勻，得水相;稱取處方量大豆卵磷脂、單硬脂酸甘油酯，溶于5.0 mL無水乙醇，得有機相;在超聲狀態下，將有機相趁熱逐滴滴入水相中，通氮氣超聲揮盡有機溶劑制得初乳，超聲細胞粉碎機分散，過膜，即得。

復乳－溶劑擴散法:精密稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、大豆卵磷脂，溶于無水乙醇為有機相，水為內水相，第一次超聲乳化，形成 W/O初乳;加外水相(含表面活性劑1% 泊洛沙姆188)，第二次超聲乳化，形成W/O/W復乳，然后復乳加入稀釋水相(0～2℃)中，分散機分散15 min(10000 r/min)，通氮氣下超聲揮發有機溶劑后，用超聲細胞破碎儀在7 AM振幅下破碎10 min，然后復乳加入稀釋水相(0～2℃)冷卻固化2 h，過膜，即得。

采用濁度法初步評價各種方法制備的VCR－SLN粒徑的大小，其原理為脂質材料和乳化劑等在500～800 nm范圍內幾乎沒有吸收，不影響透光率，因此用650 nm處的吸光度值作為體系濁度來間接反映粒子大小。在相同條件下，濁度小者其粒徑較小。結果見表1。故采用復乳－溶劑擴散法制備VCR－SLN。

表1 不同制備方法結果比較

2.3.4 破碎振幅和時間考察

復乳－溶劑擴散法制備的空白固體脂質納米粒分成10份，其中 5份分別在 3，5，8，10，15 AM 超聲破碎 6 min，另 5份在 10 AM 下超聲破碎時間分別為 1，3，6，8，10 min，用濁度法初步評價SLN粒子大小。確定超聲破碎時間為6 min，振幅為8 AM。

2.4 VCR－SLN處方優化

在預試驗及單因素考察的基礎上，選擇長春新堿的用量(因素A)、大豆卵磷脂的用量(因素B)、泊洛沙姆188的用量(因素C)及單硬酸酯甘油酯的用量(因素D)4個因素的3個水平，以SLN包封率、載藥量和粒徑為指標，優化處方[9]。因素水平見表2。根據以上各因素水平，以VCR－SLN正交L9(34)表進行9次試驗，測得平均包封率為36.15%，平均載藥量為1.82%，見表3。對試驗結果進行直觀分析可知，以包封率為衡量指標得出的最佳處方為A3B3C2D2;以粒徑為衡量指標得出的最優處方為A3B3C2D1，粒徑越小越好。以包封率為主要評價指標，參考粒徑，綜合分析，最終確定A3B3C2D2為最優處方，即單硬脂酸甘油酯80 mg，長春新堿10 mg，大豆卵磷脂100 mg，泊洛沙姆188150 mg。

表2 正交試驗的因素水平表

表3 L9(34)正交試驗設計及結果

2.5 性質考察

驗證性試驗:采用復乳－溶劑擴散法，按照優化后的處方制備3批 VCR－SLN，測定粒徑、包封率和載藥量，平均粒徑為(153.7±3.68)nm，包封率為 (55.12 ±1.73)% ，載藥量為(3.09 ±0.61)% 。該方法重現性較好。pH 為 5.69 ～6.22，符合靜脈注射要求。

外觀形態:取VCRSLN適量，加重蒸水稀釋，滴于銅網上，用2.0% 磷鎢酸進行染色，自然晾干后，透射電鏡下觀察納米粒的形態和大小。透射電鏡照片見圖1，所得制劑為球形或類球形，外觀形態較圓整。

粒度及分布:取VCRSLN混懸液，用高純水稀釋調至儀器顯示電信號值，折光度為90°，采用N4 PLUS納米粒度分析儀測定納米粒粒徑(d)。測得粒徑為(153.7 ±3.68)nm(n=3)，粒度多分散性指數(PI)為0.791。

圖1 VCR－SLN透射電鏡照片(×100000)

3 討論

本試驗曾嘗試用熱熔超聲法、高溫乳化－低溫固化法、復乳 －溶劑擴散法，溶劑乳化－超聲法等不同方法制備VCRSLN，由于長春新堿為水溶性，見熱和光易分解，不易采用熱熔和高溫等條件，最終確定復乳－溶劑擴散法，且該方法適合水溶性強藥物，包封率高。若采用高壓勻質機制備水溶性的SLN將更有優勢。

骨架脂質的種類是SLN能否形成的關鍵因素。單硬脂酸甘油酯既可作為一種脂質材料，又是一種弱的W/O型乳化劑，在制備SLN初乳時，能穩定初乳。硬脂酸SLN穩定性明顯低于單硬脂酸甘油SLN，可能是由于硬脂酸是直鏈分子結構，黏度較大，晶格的有序性較高，在貯存過程中易發生晶型轉化，產生凝膠化現象[10]。

常用的乳化劑有大豆磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酸酯等，都可用來穩定SLN，在制備復乳時，采用泊洛山姆188作為乳化劑。泊洛沙姆188有空間位阻作用，一方面可阻止納米粒的聚集從而增加其穩定性，另一方面又有避免體內網狀內皮系統吞噬的趨勢[11]。細胞破碎儀破碎振幅對固體脂質納米粒有顯著影響，在單因素考察中，破碎振幅6 AM，破碎時間8 min，效果最理想，能得到藍色乳光SLN，且形成的SLN較穩定。由正交試驗結果可知，乳化劑卵磷脂的用量對SLN粒徑大小影響較大。卵磷脂不僅影響SLN的粒徑，對載藥SLN的包封率也有較大影響[12]。

SLN包封率測定方法有葡聚糖凝膠柱法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等，其原理均為采用一定的方法使包封的藥物和游離藥物分離，測定包封或游離藥物的濃度，計算包封率。離心法雖然簡便但不可靠，不能準確評價包封率的大小。本研究也曾嘗試葡聚糖凝膠柱法分離VCR－SLN中的游離藥物，試驗中采用蒸餾水作為洗脫劑時，由于長春新堿為水溶性，在洗脫過程中SLN在葡聚糖凝膠中容易洗脫，導致包封率過高，且操作煩瑣。采用透析法測定VCR－SLN包封率，考察在透析2 h左右游離藥物基本達到透析平衡，且在4 h內不發生嚴重滲漏。為保證透析完全而SLN不滲漏，故選擇2.5 h為其透析時間。

由于長春新堿為水溶性，與脂質的結合能力較差，使得VCR－SLN的包封率低于脂溶性好的藥物。對于水溶性藥物，應根據所載藥物的性質選擇與其結合力好的脂質和乳化劑進行優化，提高藥物的脂溶性，減緩藥物的釋放[13]。總體來說，本方法制備SLN較適合水溶性藥物，適用性廣泛。新型給藥系統是改善長春新堿不良反應大、生物利用度低的最好方法。目前，長春新堿脂質體雖已進入了臨床研究，但其臨床耐受性及藥物累積毒性仍需密切關注。如何使長春新堿達到更加精確的靶向治療，進一步降低其不良反應，延長其作用時間，將是長春新堿新型給藥系統不斷的追求。本研究中成功制備了VCR－SLN，制備工藝簡單，考察制劑質量較理想，為進一步開發療效好、毒性低的長春新堿制劑奠定了基礎。

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