缺血-再灌注對甲床損傷機制的實驗研究

歐春培 利春葉 李曉文 陳國藝 賈賽雄

南方醫科大學附屬深圳寶安醫院上肢顯微外科，廣東 深圳 518101

缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）所致人體各個組織和器官的損傷在臨床并不少見，包括術中為避免出血人為阻斷組織和器官的供血后再灌注的損傷。如骨科常用止血帶限時地壓迫主要供血血管而達到四肢手術和創傷出血中的止血，臨床中筆者觀察到手外傷患肢正常使用止血帶，缺血再灌注后未受傷手指指甲也會出現畸形生長，其機制尚不清楚。本研究在動物模擬實驗的基礎上探討使用止血帶后缺血再灌注對甲床的損傷及其相應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Trizol購自分子探針公司，RT-PCR和熒光定量檢測Real Time試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實驗動物

健康雄性大耳白兔 50只，體重（6.0±1.2）kg，購自中山大學動物實驗中心。動物隨機分為5組：對照組、缺血30、60、90、120 min組，每組各 10只。

1.3 缺血再灌注動物模型的制備

3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（1 mg/kg），固定實驗組大耳白兔，于右后肢根部上止血帶，松緊度以腘動脈搏動消失為準，分別于缺血30、60、90、120 min再灌注1 h后剝離甲板，用于后續試驗。

1.4 SOD活性的測定

手術取出的局部甲床組織勻漿，嚴格按照試劑盒的說明書操作，采用分光分析法檢測標本中超氧化物歧化酶（SOD）活性[1]。

1.5 組織TNF-α基因表達的熒光定量PCR檢測

手術取出的局部甲床組織勻漿，按照Trizol和反轉錄試劑盒說明書操作，提取細胞總RNA和反轉出cDNA的第一鏈，按照Real-Time試劑盒說明書操作，使用ABI 7000熒光定量PCR儀檢測TNF-α基因的表達。TNF-α基因：上游引物5'-ACACCCACGTCGTAGCAAACCAC-3'，下游引物 5'-ACACCCATTCCCTTCACAGAGC-3'；內參照GAPDH基因：上游引物 5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'，反應條件為：95°C 15 s，60°C 1 min，35個循環。以內參照計算△Ct值，△Ct值越小說明基因拷貝數越多[2]。

1.6 甲床組織細胞凋亡的TUNEL檢測

手術取出的局部甲床組織予4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制備4 μm厚的切片，按試劑盒要求使用末端轉移酶介導脫氧尿苷三磷酸（TUNEL）法標記凋亡細胞。每張切片在高倍鏡下隨機選擇5個視野，計數陽性染色細胞，計算細胞凋亡率（%）=（陽性染色細胞/整個視野內的細胞）×100%。

1.7 統計學方法

運用SPSS 13.0對數據進行處理，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺血不同時間再灌注后甲床組織SOD活性的動態變化

與對照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，SOD活力無顯著改變（P>0.05），缺血 60、90、120 min 后再灌注其SOD活力顯著降低（P<0.01）。見表1。

2.2 缺血不同時間再灌注后甲床組織TNF-αmRNA表達的變化

與對照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，TNF-α mRNA的表達無顯著改變 （P>0.05），缺血60 min后再灌TNF-α mRNA的表達顯著增加（P<0.01）。見表1。

2.3 缺血不同時間再灌注后甲床組織細胞凋亡的變化

與對照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，細胞的凋亡率無顯著改變（P>0.05），缺血60 min后再灌注細胞的凋亡率隨著缺血時間的延長而相應的增加（P<0.01），但缺血90 min后細胞的凋亡率不再增加，與缺血120 min后再灌注比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 缺血不同時間再灌注后甲床組織超氧化物歧化酶活性、腫瘤壞死因子-α mRNA表達、細胞凋亡的變化（）

表1 缺血不同時間再灌注后甲床組織超氧化物歧化酶活性、腫瘤壞死因子-α mRNA表達、細胞凋亡的變化（）

注：與對照組比較，*P<0.01；與缺血再灌注60 min比較，▲P<0.01

檢測指標 對照組 缺血時間30 min 60 min 90 min 120 min SOD活性（U/mg）TNF-α mRNA細胞凋亡率（%）11.05±2.1712.67±1.515.44±1.31*5.22±1.34*5.52±1.04*22.41±3.622.31±1.2222.74±1.243.44±2.0116.21±3.10*12.27±2.54*14.67±2.33*21.66±2.14*▲13.04±3.12*20.78±1.87*▲

3 討論

人類甲床和指甲不僅具有美觀的功能，而且具有手指的抓、捏、持、拿等穩定功能，所以手指外傷后指甲的外觀及功能恢復十分重要。臨床工作中發現：一方面很多甲床損傷患者術后并發指甲畸形；另一方面上臂正常使用止血帶后，未受傷手指也出現指甲生長畸形，其機制筆者考慮可能是缺血-再灌注損傷所致[3]。

缺血-再灌注損傷是指組織器官在缺血一定程度和時間后再重新恢復血供，不僅不能使組織恢復正常的代謝功能，反而會加重損傷，甚至使病情更加嚴重的一種病理生理現象[4]。缺血-再灌注損傷中氧自由基的產生是最主要的損傷因素，其不僅直接損傷再灌注的細胞，而且還會激發一系列的炎性反應。SOD可以高效的清除氧自由基[5]，而筆者的研究顯示缺血再灌注后甲床組織中的SOD顯著減少。TNF-α也是體內一個重要的炎癥因子，由巨噬細胞產生，其表達的升高可誘導細胞的凋亡，同時還可以誘導氧自由基的產生，進一步加重損傷[6]。筆者的研究也顯示了甲床組織缺血再灌注后TNF-α mRNA的表達顯著升高（P<0.01），并且甲床組織細胞的凋亡率也相應的升高。有研究提示，在手外傷手術松止血帶后可以使用一些氧自由基清除劑來預防甲床組織凋亡的發生，或者缺血預處理較少相關炎癥因子的產生來達到預防術后指甲畸形的發生。筆者的研究顯示甲床組織缺血30 min后再灌注SOD活力、TNF-α mRNA表達和細胞凋亡率無顯著改變（P>0.05），說明短暫的缺血再灌注不會導致甲床的損傷，所以嚴格控制止血帶的時間是預防術后指甲畸形的一個有效方法。

綜上所述，本研究顯示缺血60 min后再灌注可以誘發甲床細胞凋亡的發生，SOD的減少和TNF-α表達的升高是導致細胞凋亡的主要原因。甲床損傷患者術后并發指甲畸形一方面是由于甲床自身損傷，另一方面可能是缺血-再灌注損傷所致。而上臂正常使用止血帶后，未受傷手指也出現指甲生長畸形，其原因可能是由缺血-再灌注直接損傷所致。

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[3]肖海濤，岑瑛，陳衛鑫，等.以指動脈分支血管為蒂指側方皮瓣修復手指甲床缺損[J].中國修復重建外科雜志，2011，25(9)：1140-1142.

[4]Zaouali MA，Ben AH，Padrissa-alts S，et al.Pharmacological strategies against cold ischemia reperfusion injury[J].Expert Opin Pharmacother，2010，11（4）：537-555.

[5]張郁林，黃燁，周波.缺血預處理對肺缺血再灌注損傷保護作用的研究進展[J].現代醫學，2011，39（4）：498-501.

[6]張陽，周輝，張燕，等.三種不同組織移植方法一期修復外傷性甲床缺損：40例51指甲床的隨訪比較[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（8）：3385-3388.