南極微生物絮凝劑產生菌的篩選、分子鑒定及適應性研究

杜 寧

(國家海洋局 第一海洋研究所 海洋活性物質重點實驗室，山東 青島 266061)

微生物絮凝劑是一類由微生物產生的可使水中的懸浮顆粒、菌體及膠體粒子凝聚、沉淀的一類高效、安全的水處理劑[1～4]，其成分一般為糖蛋白、多糖、蛋白質、纖維素和DNA等[5]。研究表明，極地微生物較常溫微生物的胞外分泌物分子量更大、成分更復雜[6～9]。因此，作者以極地微生物為篩選目標，擬開發出在經濟培養基、低溫環境下絮凝效率高、產量大的微生物絮凝劑。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

海水、海冰和底泥為作者在第25次南極科學考察中采集。

80目過篩高嶺土。

實驗所用試劑均為分析純。

721型可見分光光度計、磁力攪拌機、恒溫振蕩培養箱、高壓滅菌鍋、PCR擴增儀、凝膠電泳儀。

1.2 培養基

通用發酵培養基：葡萄糖 20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，NaCl 3.5 g，(NH4)2SO40.2 g，尿素 0.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH值6.8～7.2，120 ℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 絮凝劑產生菌的分離和篩選

分別取海水、海冰和底泥，在蛋白胨固體培養基上采用平板劃線法分離并純化以獲得純菌種。將分離到的菌種置于液體培養基中，于5 ℃、120 r·min-1、pH值7左右條件下發酵培養7 d。取發酵液測其絮凝率，將具有良好絮凝率的菌株作為復篩菌種。

1.3.2 活性菌株的分子鑒定

細菌總RNA提取，16S rRNA基因序列擴增采用細菌16S rRNA 基因的通用引物，引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系總體積為2 μL，包括：1×PCR緩沖溶液、1.6 mmol·L-1MgCl2、4×dNTP混合物各100 μmol·L-1，引物各1.0 μmol·L-1，Taq RNA聚合酶1 U，模板RNA 1 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。將所測定菌株的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進行相似性比較分析。

1.3.3 活性菌株碳、氮源適應性研究

分別改變通用發酵培養基中的碳源、氮源，觀察活性菌株絮凝率的變化，考察其碳、氮源適應性，篩選出在經濟培養基條件下具有較高絮凝活性的菌株。

1.3.4 絮凝率測定

向100 mL燒杯中加入0.2 g高嶺土、1 mL絮凝劑樣品(微生物發酵液)、1 mL 1 g·mL-1的CaCl2溶液，加蒸餾水至總體積50 mL，調節溶液的pH值為7.0，置于磁力攪拌機上首先200 r·min-1下快攪1 min，然后80 r·min-1下慢攪4 min。靜沉2 min，吸取上清液測定其550 nm處吸光度，同時以蒸餾水代替發酵液作對照。以絮凝率(E)表示絮凝活性，按下式計算：

E=[(A-B)/A]×100%

式中：A為對照上清液的OD550值；B為樣品上清液的OD550值。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

從海水、海冰和底泥中共分離、純化得到56株菌株，經初篩得到有絮凝活性的菌株18株，再經復篩和傳代培養，得到7株具有穩定高絮凝活性菌株，見表1。

表1產微生物絮凝劑菌株篩選結果及其生存環境

Tab.1Thescreeningresultofmicrobialflocculant-producingbacteriaandtheirlivingenvironment

菌株來源溫度/℃鹽度/%水深/m絮凝率/%IS-11-10-1泥樣-1.733.738079.75I-2冰樣-10.012.1080.25I-1-2冰樣-10.012.1082.25P2-14-1泥樣-1.733.745252.50P2-14-2泥樣-1.733.745283.75P3-06-1泥樣-1.733.7297552.00P2-13-1泥樣-1.733.711483.25

從表1可看出，所篩選的7株活性菌株均來自泥樣和冰樣，表明南極產絮凝活性的微生物以生活在海冰冰層和底質沉積物中為主。這是由于海冰冰層冰晶形成的脅迫以及底質沉積物的影響造成了這些菌株胞外分泌物的多樣化與大量化，為分離純化具有絮凝活性的物質提供了基礎。

2.2 活性菌株的16S rRNA序列分析

對篩選到的7株具有絮凝活性的南極細菌基因組RNA進行擴增，獲得了長度約為1.4 kb的16S rRNA序列，經比對分析后提交GenBank數據庫，獲得其同源相似性比較結果，見表2。

表2 7株絮凝活性菌株16S rRNA序列同源性比較

從表2可看出，所分離到的7株活性菌株與GenBank數據庫已有菌株的16S rRNA序列具有很高的相似度，均在99%以上；分別隸屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、節桿菌屬(Arthrobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、沙雷菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。表明篩選到的南極活性細菌沒有專屬性，這與目前已報道的產絮凝劑微生物種類多達幾十種以上[10]相吻合。

從現有研究來看，微生物絮凝劑為多糖蛋白、粘多糖和纖維素等[11]。結合本實驗篩選到微生物的生存環境來看，正是由于南極惡劣的自然環境，迫使生活在其中的細菌需要在胞外分泌大量的活性物質來抵御環境的侵害，而這類物質同時也具備了絮凝活性，這為以后改變培養條件，刺激活性菌株提高絮凝活性提供了理論基礎。

2.3 活性菌株的碳、氮源適應性

2.3.1 碳源(表3)

表3 碳源對菌株絮凝活性的影響

從表3可知，當培養基中原有葡萄糖含量增加時，微生物的絮凝活性并沒有明顯提高，相反菌株P3-06-1失去了絮凝活性。以麥芽糖、乳糖和蔗糖作碳源時，雖然它們同屬最簡單的二糖，但是不同微生物將其降解成單糖葡萄糖的能力卻有著很大的差別，這對降低大規模發酵成本有著很大的參考意義。另外，以復雜的多糖(可溶性淀粉)為碳源時的絮凝活性為0，說明所篩選的微生物不具備降解多糖的能力，這可能是由于南極環境中碳源種類、含量較少。在最為廉價的蔗糖實驗中，菌株I-2、I-1-2、P2-14-1、P2-14-2和P2-13-1的絮凝率保持在80%以上，表明其具有碳源普適性。

2.3.2 氮源(表4)

表4 氮源對菌株絮凝活性的影響

從表4可知，南極產微生物絮凝劑活性菌對分子量小、結構簡單的無機營養鹽有著更好的利用能力。在最為廉價的氯化銨實驗中，菌株P2-13-1、I-2的絮凝率分別為85.00%、41.06%；而在較廉價的硫酸銨實驗中，菌株I-2、P2-14-1和P2-13-1均表現出較高的絮凝率。表明菌株I-2和P2-13-1具有氮源普適性。

3 結論

從南極海水、海冰、底泥中分離得到7株產絮凝劑的菌株。分子鑒定表明，篩選到的南極活性細菌沒有專屬性，分別隸屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、節桿菌屬(Arthrobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、沙雷菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)。改變培養基中碳源和氮源的組成并觀察絮凝率的變化，篩選出在經濟培養基條件下具有較高絮凝活性，同時對碳源和氮源具有普適性的菌株I-2和P2-13-1，可以作為下一步大規模發酵研究微生物絮凝劑的實驗菌種。

參考文獻：

[1] 程金平,鄭敏,張蘭英,等.影響微生物絮凝劑產生的因素研究[J].環境科學與技術，2001，24(3)：28-31.

[2] 王鎮,王孔星,謝裕敏,等.幾株微生物絮凝劑產生菌的特性研究[J].微生物學報，1995，35(2)：121-127.

[3] Lecy N,Magdassis S,Bar-Qr Y.Physico-chemical aspects in flocculation of bentonite suspensions by a cyanobacterial bioflocculant[J].Water Research，1992，26(2)：249-259.

[4] Toeda K，Kurane R.Microbial flocculant fromAlcaligenescup-idusKT201[J].Agri Biol Chem，1991，55(11)：2793-2799.

[5] 敖黎鑫,邵承斌,盧輝,等.微生物絮凝劑產生菌HF-8的篩選與培養條件優化[J].重慶工商大學學報(自然科學版)，2009，26(5)：451-456.

[6] Blunt J W，Copp B R，Munro M G H，et al.Marine natural products[J].Nat Prod Rep,2004，21(1)：1-49.

[7] Mincer T J，Jensen P R，Kauffman C A，et al.Wide spread and persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean sediments[J].Appl Environ Microbiol，2002，68(10)：5005-5011.

[8] Stach J E M，Maldonado L A，Masson D G，et al.Statistical approaches for estimating actinobacterial diversity in marine sediments[J].Appl Environ Microbiol，2003，69(10)：6189-6200.

[9] Dawid W,Gillikowski C A,Hirsch P.Psychrophilic myxobacteria from antarctic soils[J].Polarforschung,1988，58(2/3)：271-278.

[10] 黃衛紅,熊金水,劉彬彬.微生物絮凝劑EBU-1的化學性質分析[J].環境工程學報，2009，3(5)：825-828.

[11] 王衛平,朱鳳香,陳曉旸,等.微生物絮凝劑的研究進展及其應用前景[J].安徽農學通報，2009,15(19):45-48.