菟絲子中總黃酮的閃式提取工藝及近紅外透射光譜含量分析方法

楊天鳴,李 純,付海燕,付友珍,常夢穎,楊 琛

(中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074)

菟絲子(Cuscutachinensis)為旋花科植物南方菟絲子(CuscutaaustralisR.Br.)或菟絲子(CuscutachinensisLam.)的干燥成熟種子[1]。具有滋補肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉等功效。菟絲子的主要活性成分為黃酮類化合物，其中以槲皮素、蘆丁及山奈酚為主[2]，具有清除氧自由基、擴張血管、改善腦循環(huán)、抑制血小板活化因子(PAF)等作用，近年來對菟絲子的研究已成為熱點。

目前提取中藥黃酮類化合物的方法主要有：溶劑提取法[3]、微波提取法[4]、超聲提取法[5]、半仿生提取法[6]、超臨界流體萃取法[7]。測定黃酮類化合物含量的方法主要有：紫外分光光度法[8]、高效液相色譜法[9]、高效毛細管電泳法[10]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、近紅外光譜法[11]等。閃式提取器是一種用于植物材料快速提取的新型提取器，其原理是依靠高速的機械剪切力和攪拌力，使植物有效成分迅速溶解分散到提取溶劑中，具有高效、快速、不需加熱、不破壞成分、適宜多種溶劑等優(yōu)點。

作者在此采用閃式提取法對菟絲子中總黃酮進行提取，并建立近紅外透射光譜定量分析模型對提取液中總黃酮含量進行直接測定。

1 實驗

1.1 材料、試劑及儀器

菟絲子藥材(產(chǎn)地四川，購自武漢德仁堂大藥房)，經(jīng)中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定。

蘆丁對照品，中國藥品制品生物鑒定所；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，國藥集團化學試劑公司。實驗用水均為純水。

JHBE-50A型閃式提取器，河南金鼐科技發(fā)展有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Antaris Ⅱ型傅立葉變換近紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；DFF-100型手提式高速中藥粉碎機，溫嶺林大機械有限公司；DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科技儀器有限公司。

1.2 樣品處理

將菟絲子用水洗凈，置于真空干燥箱中真空干燥12 h，取出，粉碎，過60目篩，再次干燥12 h，置玻璃干燥器內(nèi)，備用。

1.3 蘆丁標準溶液的配制

準確稱取蘆丁對照品(60 ℃干燥至恒重) 0.0200 g于100 mL燒杯中，用30%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.200 mg·L-1的蘆丁標準溶液。

1.4 菟絲子供試品溶液的配制

配制一定濃度的乙醇，按照一定的料液比(mg∶mL,下同)浸泡菟絲子粉末樣品12 h。用閃式提取器采用間歇式方式提取浸泡樣品，電壓100～150 V，每次30 s，累計8 min。提取液靜置1 h后,用布氏漏斗抽濾得澄清濾液，即得菟絲子供試品溶液。將其裝入棕色廣口瓶，置陰涼處備用。

1.5 蘆丁標準曲線的繪制[3]

準確吸取蘆丁標準溶液4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL，分別置于50 mL容量瓶中，用30%的乙醇適量稀釋。加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，放置5 min；再加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min；然后加入5 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混勻，放置10 min后，用30%的乙醇稀釋至刻度。以不加菟絲子供試品溶液的空白溶液為參比，用紫外分光光度計于371 nm處測定吸光度值。以蘆丁濃度c(mg·mL-1)為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。擬合線性回歸方程為y=11.21250x-0.00960，相關系數(shù)R=0.99999。

圖1 蘆丁標準曲線

1.6 近紅外透射光譜測定方法[4]

分別吸取菟絲子供試品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL轉(zhuǎn)入到10 mL容量瓶中，用50%的乙醇稀釋至刻度。將待測樣品裝入樣品池，使用透射附件采集近紅外光譜。采集條件：采集光譜范圍4000～10 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率8 cm-1。每個樣品測定10次，每次測定采集3張圖譜，取其平均光譜數(shù)據(jù)用于處理。采集的光譜數(shù)據(jù)用TQ Analyst智能分析軟件處理和計算。同一樣品溶液按照1.5紫外分光光度法測定總黃酮含量，用于近紅外透射光譜定量分析建模。

2 結(jié)果與討論

2.1 閃式提取工藝條件

不同閃式提取工藝條件下所得菟絲子供試品溶液的總黃酮含量測定結(jié)果見表1。

表1 不同閃式提取工藝條件下菟絲子供試品溶液的總黃酮含量測定結(jié)果

由表1可知，當提取溶劑為50%的乙醇、料液比為1∶8時，供試品溶液的總黃酮含量最高。在此最優(yōu)提取工藝條件下，平行提取3組供試品溶液，總黃酮含量平均為0.0200 mg·mL-1，標準偏差為0.2%。表明閃式提取法的提取穩(wěn)定性比較好，在一定條件下提取液中總黃酮含量僅與提取溶劑濃度及料液比有關。

2.2 近紅外透射光譜定量分析模型的建立

2.2.1 菟絲子供試品溶液的近紅外透射光譜圖

采集不同總黃酮含量的菟絲子供試品溶液的近紅外光譜，結(jié)果見圖2。

1～7,總黃酮含量(mL):3,4,5,6,7,8,9

2.2.2 定量分析光譜波段選擇

黃酮的近紅外透射光譜吸收峰大約在5800 cm-1處，而水的吸收峰在5100 cm-1和6800 cm-1兩處，因而必須選擇合適的波段進行分析才有效。通過全譜區(qū)段的考察發(fā)現(xiàn)，5750～5986 cm-1范圍的信息量豐富，選取此波長區(qū)間進行數(shù)據(jù)處理建立的定量數(shù)學模型交叉驗證標準差(RMSECV)小，定量分析結(jié)果較好。因此，菟絲子供試品溶液的定量分析模型波段選擇如圖3所示。

圖3 菟絲子供試品溶液的近紅外光譜定量預測模型波段選擇

2.2.3 主成分分析

主成分分析是用數(shù)目較少的新變量成分代替原變量，而且新變量最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構特征，同時去除無用信息。通過主成分變換可有效地將數(shù)據(jù)降維，以消除眾多信息共存中相互重疊的部分。在5750～5986 cm-1信息豐富的范圍內(nèi)提取近紅外透射光譜的主成分，考察預測殘差平方和(Predictive residual error sum of square，PRESS)與主成分數(shù)間的關系，結(jié)果見圖4。由最小PRESS 確定最佳主成分數(shù)為2。

圖4 PRESS與主成分數(shù)關系

2.2.4 偏最小二乘法(PLS)回歸分析

菟絲子供試品溶液總黃酮含量的定量預測模型是通過PLS回歸(主成分數(shù)為2)和交叉驗證來實現(xiàn)。用PLS回歸建立模型時，在135個樣本中隨機選擇45個樣本作為驗證集(Validation),其余90個樣本作為校準集(Calibration)，用相關系數(shù)R、校正標準差(RMSEC)、預測標準差(RMSEP)來評價校準集，通過交叉驗證標準差(RMSECV)和相關系數(shù)R來評價驗證集。

菟絲子供試品溶液的PLS回歸分析結(jié)果見圖5。

圖5 PLS回歸分析結(jié)果

一個好的模型應該具有較小的RMSEC、RMSEP及較高的相關系數(shù)，本實驗所建立模型的相關系數(shù)為0.99985、RMSEC為0.0685、RMSEP為0.160，表明模型具有相當好的線性以及預測能力。模型的交叉驗證結(jié)果見圖6。

圖6 交叉驗證結(jié)果

由圖6可知，交叉驗證結(jié)果的相關系數(shù)為0.99966，交叉驗證標準差(RMSECV)為0.102。表明模型具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 近紅外透射光譜定量分析模型評價

分別精密吸取菟絲子供試品溶液4.5 mL、5.5 mL、6.5 mL、7.5 mL轉(zhuǎn)入10 mL的容量瓶中，用50%的乙醇定容至刻度。按照1.6方法進行近紅外透射光譜掃描。將數(shù)據(jù)代入菟絲子供試品溶液的總黃酮含量定量預測模型進行計算，所得結(jié)果與紫外分光光度法測定結(jié)果相比較，如表2所示。

表2 總黃酮含量測定結(jié)果比較/μg·mL-1

由表2可知，近紅外透射光譜偏最小二乘法模型與紫外分光光度法測量的總黃酮含量相差很小。

3 結(jié)論

用閃式提取法提取菟絲子中的總黃酮，確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶8(mg∶mL)，以50%的乙醇為溶劑提取8 min。用PCA結(jié)合PLS法建立近紅外透射光譜定量數(shù)學模型對提取液中總黃酮含量進行分析，所建立模型具有較好的線性關系，RMSEC、RMSEP以及RMSECV值均較小，分別為0.0685、0.160、0.102。利用該模型預測和紫外分光光度法測量的總黃酮含量相差很小。表明近紅外透射光譜結(jié)合PLS回歸是一種快速、簡便、無損、穩(wěn)定的定量分析方法，適用于中藥提取過程的在線檢測和質(zhì)量控制分析。

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