牛病毒性腹瀉-黏膜病的流行病學調查

鄧明亮 費文濤 紀素坤 張 瑞 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農業大學動物醫學院，武漢 430070；2.華中農業大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

牛病毒性腹瀉（BVD）又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的一種病理過程復雜、臨床表現多樣的傳染病。病牛臨床表現為腹瀉，急、慢性黏膜病，持續性感染與免疫耐受，母畜流產、產死胎和畸形胎等[1]。本病世界廣泛流行，1980年李佑民首次從流產胎兒脾臟中分離到BVDV，證實了我國也存在本病。其后在全國20多個省、市都相繼發現了該病的存在[2-4]。該病較少表現特征性臨床癥狀，且多伴有持續感染和免疫耐受等隱性感染，加之缺乏安全有效的BVD疫苗，給該病的防控帶來了很多困難，導致我國牛群BVDV感染日趨嚴重[5]。BVDV除感染肉牛、奶牛、水牛和牦牛外，還可感染羊、豬、鹿等多種家養和野生動物[6-7]。楊得勝等[8]對福建省9個地區2006-2008年的15個大型牛場和56個散養戶牛進行血清學調查，品種包括奶牛、肉牛和水牛，平均陽性率達93.1%。菅復春等[9]對河南省的6個奶牛場、5個肉牛養殖場的181份牛奶樣品和395份血清樣品進行BVD抗體的檢測，牛奶樣品平均陽性率為58.6%，肉牛血清樣品平均陽性率為31.39%。高雙娣等[10]利用細胞中和試驗對陜西、甘肅、寧夏、青海和四川5?。▍^）部分地區的黃牛群和牦牛群進行BVDV調查，結果黃牛群BVD陽性檢出率為46.15%，牦牛群BVD陽性檢出率為30.08%。

BVD可嚴重影響牛的繁殖和生產，給養牛業造成嚴重的經濟損失；而我國的規?；B牛場主要集中在北方地區，為了解北方地區牛群中該病感染情況，我們對采自北方地區2個大型屠宰場（屠宰的肉牛主要來源于東北各地養殖場）和青海地區的牦牛血清進行了本病的流行病學調查，以便為今后對該病的凈化與防控工作提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒和牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒，均購自IDEXX。收集內蒙古通遼市大型屠宰場肉牛血清276份，遼寧大連市大型屠宰場肉牛血清164份。屠宰場的肉牛均來自北方各地養殖場。牦牛血清：采自青海省祁連縣、天駿縣、湟源縣、海晏縣和門源縣5個縣共400份。

1.2 方法

1）牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒操作方法：若于冰箱中保存，應使所有組件于18～30℃下平衡30min；將SNAPBVD檢測器放置于平整的表面上，在整個檢測過程中，均必須將SNAPBVD檢測器保持在水平位置，以確保結果精準；將150μL樣品加入干凈的樣品管內；將200μL結合物加入樣品管內；將樣品管蓋上，并上下顛倒3～5次以充分混勻。將含有結合物混合液的加蓋樣品管放入45℃的培養箱中，至少培養10min；將樣品管中的內容物注入樣品孔中；15～60s后，樣品會流過結果窗并達到啟動環；在啟動環中呈色時，穩固按下啟動器，直到啟動器與SNAP檢測器的本體齊平為止，用力按下；10min后判讀檢測結果。

2）牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒操作方法：所有試劑在使用前一律恢復至室溫（18～25℃），輕輕搖動或旋轉，使試劑混合均勻。用移液器在酶標板每孔中加入100μL樣品稀釋液，在相應的陰性和陽性對照孔中加入25μL對照血清，平行做2孔，其他各孔均加入25μL檢測血樣；輕彈酶標板或用振蕩器振蕩，將酶標板中的溶液充分混勻；在室溫（18～25℃）孵育90min，然后將反應孔中的溶液吸出。在每個反應孔中加入約300μL洗滌液進行洗滌，洗滌5次；每次洗滌后吸出所有孔中的液體，在最后1次洗滌完成后，將酶標板在吸水紙上拍干；再在每個反應孔中加入100μL酶標抗體，室溫下（18～25℃）孵育30min；再洗滌5次，在每個反應孔中加入100μLTMB底物，室溫下避光孵育10min后，每個反應孔中加入100μL終止液終止反應；將酶標儀在空氣中調零，用450nm波長測定和記錄樣品以及對照的吸光值。

3）檢測判讀?？乖瓩z測判讀：陽性結果（PI狀態）——若樣品點中所呈現的藍色比背景深時，則該樣品被判為陽性。陰性結果（Non-PI（非持續感染）狀態）——若樣品點中的藍色與背景相同或比背景淺時，則該樣品被判為陰性。

抗體檢測判讀：陽性對照的平均值（PCX）與陰性對照的平均值（NCX）之間，P-N的差必須大于或等于0.150的吸光（OD）值；另外，陰性對照平均值（NCX）必須小于或等于0.250的OD值，表明檢測結果有效。計算待檢血清的（樣品OD值-陰性OD值）/（陽性OD值-陰性OD值）（S/P值），若S/P值＜0.200，則判為BVDV抗體陰性；S/P值＞0.300，則判為BVDV抗體陽性。

2 結果與分析

2.1 抗原檢測結果

對采自內蒙古通遼市、遼寧大連市的2個大型屠宰場共440份肉牛血清和青海省5個縣的400份牦牛血清進行了BVD血清學抗原檢測，結果顯示3個地區均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率達1.96%，見表1。

BVD血清學抗原檢測結果顯示不同品種感染情況也不同，肉牛、牦牛血清抗原陽性數均為3份，但陽性率分別為0.68%、0.75%，見表2。

2.2 抗體檢測結果

隨機抽取668份血清（肉牛血清392份、牦牛血清276份）進行BVD血清學抗體檢測，包括以上抗原檢測為陽性的6份血清，結果顯示共檢出陽性血清392份，平均陽性率58.68%，最高陽性率達84.48%，最低陽性率20%，見表3；并且血清學抗原陽性的6份血清抗體檢測均為陰性，表明肉牛、牦牛群均存在PI牛，PI牛檢出率分別為 0.77%、1.09%，見表 4。

不同品種的血清學抗體陽性率也不同，肉牛、牦牛血清抗體陽性數分別為248、144份，陽性率分別為63.27%、52.17%，見表5。

表1 不同地區BVD血清學抗原檢測結果

表2 不同品種BVD血清學抗原檢測結果

表3 不同地區BVD血清學抗體檢測結果

表4 PI牛檢測結果

表5 不同品種BVD血清學抗體檢測結果

3 討 論

近年來，我國養牛業發展迅速，但隨著養牛規模的不斷擴大，BVD也呈迅猛傳播之勢，對養牛業造成了巨大損失，給整個畜牧業發展帶來了嚴重影響。雪梅等[11]于2002-2006年對四川阿壩牧區的牦牛進行了調查和統計，阿壩、紅原和若爾蓋3個縣部分地區共發病1983頭，死亡362頭，死亡率為18.26%；通過BVD瓊脂擴散試驗和BVD血清中和試驗進行血清學檢查，陽性率分別為25.0%和42.3%。薛艱省等[12]對青海省高寒牧區牦牛進行了感染情況調查，對來自瑪沁縣的87份血清樣品進行檢測，結果在87份血清樣品中檢出陽性10份，占11.49%；流行病學調查久治縣存欄牛7715頭，發病1750頭，死亡225頭，發病率和死亡率分別為22.68%和2.92%。邱昌慶等[13]對山東、河南和河北省的6個規?；馀鲞M行抗體、抗原檢測，證實我國中原地區肉牛群中BVD感染嚴重。

本次對內蒙古、遼寧肉牛和青海牦牛群進行血清學調查，結果顯示3個地區均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率為1.96%。血清學抗體平均陽性率為58.68%，最高陽性率達84.48%，最低陽性率20.00%。表明BVD在我國北方牛群中普遍存在，而且感染率和感染范圍日趨嚴重。分析其主要原因可能是集約化規模養殖的發展提高了牛只間傳染的概率；近年來北方地區極端天氣的多發引起機體抵抗力下降；該病特征性臨床癥狀較少，在實際生產中易被忽視；牛群缺乏系統的監測防控措施等。

調查發現，檢出的6份抗原陽性血清其對應血清抗體檢測均為陰性，表明牛群中存在PI牛，肉牛、牦牛PI牛檢出率分別為0.77%、1.09%，與國外報道的PI牛檢出率（0.5%～2.0%）基本相符[14]。而肉牛、牦牛群抗體陽性率分別為63.27%、52.17%，這說明血清抗體陽性率與PI牛檢出率二者之間沒有線性關系，與張俊杰等[15]調查的結果一致。雖然PI牛的存活時間一般不超2a，但終生帶毒并通過鼻液、唾液、尿液、眼淚和乳汁等分泌物向體外排毒，成為該病的危險傳染源，在規?；B殖場中隨著牛只的頻繁轉群變動1頭PI牛就可以在其1a左右的生存期內使整個牛群感染BVDV。因此必須制定有效的BVD清除計劃，加強PI牛的檢測，全群篩查并淘汰PI牛，逐步達到凈化牛群的目的。

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