牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)價(jià)

羅海峰 葛艷華 Gu Hao-yi Anton Mestek Jr. 翁立楠 Christian Schelp Christoph Egli Serge Leterme

1.北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，北京 101300；2.IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook-Maine 04092；3.IDEXX Switzerland AG，Liebefeld-Bern 3097

牛病毒性腹瀉-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的主要發(fā)生于牛的一種急性、熱性傳染病，在臨床上引起一系列復(fù)雜的癥狀，主要包括牛的病毒性腹瀉、急慢性黏膜病、免疫耐受和持續(xù)性感染、免疫抑制、繁殖障礙、血小板減少和出血癥等，致病機(jī)理非常復(fù)雜[1-3]，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。同時(shí)，牛病毒性腹瀉病毒是一種世界范圍廣泛分布的危害動(dòng)物健康的重要病原體，它不僅感染牛，而且能夠感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及其它野生動(dòng)物[1,3]。

妊娠母牛感染非致細(xì)胞病理變化型BVDV后，此時(shí)胎兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，不能識(shí)別外來(lái)的BVDV，初生犢牛一旦成活，其臨診癥狀表現(xiàn)正常，血清學(xué)反應(yīng)呈陰性，而此時(shí)犢牛則處于免疫耐受狀態(tài)，成為持續(xù)感染（Persistently infected，PI）者，持久帶毒、排毒，PI牛也就成為了BVDV在牛群中流行的傳染源[1-5]。有些PI牛會(huì)表現(xiàn)出黏膜病的癥狀（腹瀉、發(fā)育不良、久配不孕等），但是有些PI牛不表現(xiàn)任何癥狀，從而被當(dāng)作正常牛只一直在牛群飼養(yǎng)[6]，并使BVDV在牛群中傳播。可見(jiàn)對(duì)于BVDV持續(xù)感染牛的檢測(cè)將有利于牛群生長(zhǎng)發(fā)育。本文對(duì)于新近開(kāi)發(fā)的牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)（BVDV Ag POC）試劑盒的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，通過(guò)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行比較探索其用于檢測(cè)BVDV持續(xù)感染牛的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

Erns（gp48）蛋白由IDEXX Switzerland AG瑞士研發(fā)中心提供；不同亞型BVDV抗原陽(yáng)性血清樣本由IDEXX Laboratories Inc.美國(guó)研發(fā)中心提供；BVDV Ag ELISA試劑盒及BVDV Ag POC試劑盒均來(lái)自于IDEXX Laboratories Inc.；全血樣本、血漿樣本以及小耳組織樣本來(lái)自于牛場(chǎng)。

1.2 方法

1）BVDV Ag ELISA檢測(cè)血清血漿的操作方法。血清血漿樣本直接加入到ELISA板內(nèi)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育和后續(xù)操作。設(shè)2孔陰性對(duì)照和2孔陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照平均值減去陰性對(duì)照平均值，其差必須大于或等于0.150；通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品與陰性對(duì)照平均值的差值（S-N）來(lái)判定BVDV抗原結(jié)果。如果S-N值小于或等于0.300，判為BVDV抗原陰性；如果S-N值大于0.300，判為BVDV抗原陽(yáng)性。

2）BVDV Ag ELISA檢測(cè)小耳組織樣本的操作方法。對(duì)于小耳組織樣本首先采用耳組織浸泡液在室溫下浸泡12～24h后，混勻，取樣加入ELISA板內(nèi)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育和后續(xù)操作。設(shè)2孔陰性對(duì)照和2孔陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照平均值減去陰性對(duì)照平均值，其差必須大于或等于0.150；通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品與陰性對(duì)照平均值的差值（S-N）來(lái)判定BVDV抗原結(jié)果。如果S-N值小于或等于0.200，判為BVDV抗原陰性；如果S-N值小于或等于0.300但大于0.200，判為可疑；如果S-N值大于0.300，判為BVDV抗原陽(yáng)性。

3）BVDV持續(xù)感染牛的判定。對(duì)于第1次采樣檢測(cè)BVDV抗原陽(yáng)性的牛只，在7～14d后再次進(jìn)行采樣，并使用BVDV Ag ELISA進(jìn)行檢測(cè)。如果再次檢測(cè)為BVDV抗原陽(yáng)性，則該動(dòng)物為BVDV持續(xù)感染牛；如果再次檢測(cè)結(jié)果為BVDV抗原陰性，則該動(dòng)物不是BVDV持續(xù)感染牛。

4）BVDV Ag POC檢測(cè)全血、血清和血漿的操作方法。將檢測(cè)裝置放在平整的桌面上，使用提供的滴管滴將1滴樣本滴入檢測(cè)裝置的加樣孔中，1min內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)時(shí)，15min后觀察結(jié)果；質(zhì)控線位置呈現(xiàn)紅色條帶顯示試驗(yàn)有效；檢測(cè)線的顏色強(qiáng)于背景結(jié)果，判為陽(yáng)性；檢測(cè)線的顏色與背景顏色相同或弱于背景顏色，結(jié)果為陰性。

5）BVDV Ag POC檢測(cè)耳組織樣本的操作方法。耳組織樣本裝入樣品管中，然后滴加8滴（對(duì)于小耳組織樣本）或者16滴（對(duì)于大耳組織樣本）緩沖液，浸泡5min以上，徹底混勻后使用提供的滴管滴將1滴樣本滴入檢測(cè)裝置的加樣孔中，1min內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)時(shí)，15min后觀察結(jié)果。質(zhì)控線位置呈現(xiàn)紅色條帶顯示試驗(yàn)有效；檢測(cè)線的顏色強(qiáng)于背景顏色，判為陽(yáng)性；檢測(cè)線的顏色與背景顏色相同或弱于背景，結(jié)果為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)于Erns蛋白的檢測(cè)及稀釋靈敏度比較

對(duì)于采用基因工程表達(dá)的Erns蛋白進(jìn)行系列稀釋，并且采用BVDV Ag ELISA和BVDV Ag POC分別進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，BVDV Ag POC可以有效檢測(cè)Erns，并且對(duì)于Erns的稀釋靈敏度與ELISA相同。

2.2 對(duì)于BVDV 1型和2型血清的檢測(cè)

使用BVDV Ag POC檢測(cè)21份已知病毒亞型的BVDV Ag陽(yáng)性血清，其中包含有13份BVDV 1型血清和8份BVDV 2型血清，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，BVDV Ag POC可以有效檢測(cè)BVDV 1型和2型病毒。

2.3 對(duì)于全血樣本的檢測(cè)

自9個(gè)牛場(chǎng)收集824份全血樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。采用BVDV Ag ELISA對(duì)于全血樣本分離得到的血漿進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采血進(jìn)行檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染（PI），并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 Erns蛋白系列稀釋的檢測(cè)結(jié)果

表2 對(duì)21份已知BVDV亞型血清樣本的檢測(cè)

由表3可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于全血樣本檢測(cè)的靈敏度是100.0%，特異性為99.1%。

2.4 對(duì)于血漿樣本的檢測(cè)

自9個(gè)牛場(chǎng)收集587份血漿樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果；同時(shí)采用BVDV Ag ELISA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采血進(jìn)行檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染，并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于血漿樣本檢測(cè)的靈敏度是100.0%，特異性為99.4%。

表3 BVDV Ag POC檢測(cè)全血樣本

表4 BVDV Ag POC檢測(cè)血漿樣本

表5 BVDV Ag POC檢測(cè)小耳組織樣本

2.5 對(duì)于耳組織樣本的檢測(cè)

自4個(gè)牛場(chǎng)收集400份小耳組織樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果；同時(shí)進(jìn)行BVDV Ag ELISA檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采樣檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染，并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于全血樣本檢測(cè)的靈敏度是100%，特異性為100%。

3 討論

目前OIE推薦的BVDV抗原檢測(cè)方法，也是國(guó)際貿(mào)易標(biāo)準(zhǔn)方法，包括病毒分離（Virus Isolation）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫組化（Immunohistochemistry）以及核酸檢測(cè)（Nucleic acid detection）[2]。目前ELISA方法作為檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的經(jīng)典方法，已經(jīng)被應(yīng)用于多個(gè)國(guó)家的凈化計(jì)劃中，其特異性強(qiáng)、靈敏度和可靠性都很高[4,7-8]。但是由于目前OIE推薦的4種方法均需要一定的實(shí)驗(yàn)條件，并且試驗(yàn)結(jié)果需要經(jīng)過(guò)幾小時(shí)到幾天的時(shí)間才可獲得。因此開(kāi)發(fā)一種靈敏度、特異性與ELISA方法相似，同時(shí)操作簡(jiǎn)便、不需要特殊儀器的檢測(cè)方法，對(duì)于小型農(nóng)場(chǎng)的疾病防控，以及在需要盡快獲得檢測(cè)結(jié)果的場(chǎng)合下使用，具有重大的優(yōu)勢(shì)。牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒采用膠體金技術(shù)，運(yùn)用側(cè)向?qū)游鲈恚梢栽诩尤霕颖竞?5min獲得結(jié)果，所有反應(yīng)在室溫下即可完成，不需要任何其他儀器及特殊的實(shí)驗(yàn)條件，完全達(dá)到快速檢測(cè)的要求，可以滿足各種環(huán)境下對(duì)于單一樣本快速檢測(cè)的需求。

PI牛的清除是牛場(chǎng)清除BVDV的重要目標(biāo)，運(yùn)用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段檢出這些PI牛，一定要在第一時(shí)間將它們隔離出群，并盡早淘汰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BVDV Ag POC檢測(cè)標(biāo)的物為 Erns，Erns蛋白為檢測(cè)BVDV的重要靶蛋白[5,9]，該試劑盒可以準(zhǔn)確有效地檢測(cè)出樣本中BVDV的存在；對(duì)于1型和2型BVDV均可以檢測(cè)。對(duì)于824份全血樣本、587份血漿樣本以及400份小耳組織樣本的檢測(cè)顯示，所有的PI牛全被BVDV Ag POC檢測(cè)出，靈敏度達(dá)到100%，針對(duì)不同類型的樣品，BVDV Ag POC特異性略有不同，但都超過(guò)99%。該結(jié)果顯示BVDV Ag POC與ELISA方法具有極高的符合性，其性能可以滿足對(duì)于BVDV PI牛檢測(cè)的需求。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)北京地區(qū)7個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)共14028頭荷斯坦奶牛進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè).共檢出PI牛58頭，其中成母牛9頭，后備牛49頭；場(chǎng)內(nèi)陽(yáng)性率0.04～1.02%[6]。從河北省部分牛場(chǎng)采集1030份樣本進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè)，平均檢出率40.9%[10]。可見(jiàn)，BVDV廣泛存在于國(guó)內(nèi)的牛場(chǎng)中。參照瑞典凈化BVDV的經(jīng)驗(yàn)，明確牛只感染狀況，及時(shí)清除PI牛，同時(shí)控制引入的牛只，將有助于病毒的凈化。而B(niǎo)VDV Ag POC作為可以單一檢測(cè)的快速檢測(cè)試劑盒，可用于及時(shí)明確新生犢牛、引入牛只的BVDV感染狀況。同時(shí)歐洲的清除計(jì)劃也顯示出快速確定牛只感染狀況，也有利于清除病毒[1,4,7-8]。由此，牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒作為一個(gè)可以快速檢測(cè)樣品中BVDV抗原的試劑，可以成為牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV的防控及清除的有力工具。

[1]HOUE H.Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus（BVDV） infections[J].Vet Microbiol，1999，64（2-3）：89-107.

[2]OIE.Bovine viral diarrhoea[N].OIE Terrestrial Manual， 2008：701-703.

[3]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：275-278.

[4]LINDBERG A L，ALENIUS S.Principles for eradication of bovine viral diarrhoea virus（BVDV） infections in cattle populations[J].Veterinary Microbiology，1999，64（2-3）：197-222.

[5]唐大為，苑慶閣，姚樹(shù)國(guó).牛病毒性腹瀉的診斷與防控[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（3）：160-161.

[6]黃凱，張俊杰，劉英霞，等.北京地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)BVDV持續(xù)感染牛清除方案的初步實(shí)施[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2010（5）：34-35.

[7]HOUE H，LINDBERG A，MOENNIG V.Test strategies in bovine viral diarrhea virus control and eradication campaigns in Europe[J].J Vet Diagn Invest，2006，18（5）：427-436.

[8]LINDBERG A，BRNWNLIE J，GUNN G J，et al.The control of bovine viral diarrhoea virus in Europe：today and in the future[J].Rev Sci Tech，2006，25（3）：961-979.

[9]VEGA S，ROSELLl R，PATON D J，et al.Antigenic characterization of bovine viral diarrhoea virus isolates from Spain with a panel of monoclonal antibodies[J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2000，47（9）：701-706.

[10]趙月蘭，楊漢春，秦建華，等.河北省奶牛牛病毒性腹瀉-黏膜病流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（11）：36-37.