傳統藥物黃花列當提取物清除DPPH的活性研究△

許國青 王曉琴 崔佳穎 李萬強

(1.內蒙古自治區衛生干部教育培訓中心，內蒙古 呼和浩特 010031;2.內蒙古醫學院藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

黃花列當(Orobanche pycnostachya Hance)為列當科(Orobanche)列當屬植物，為多年生、二年生或一年生寄生草本，主要寄生于蒿屬植物的根上［1］。全草入藥，具有補腎助陽、強筋骨的功能，用于治療腰膝冷痛、陽痿、遺精，蒙醫藥還用于治療碳疽，民間常做肉蓯蓉的代用品［2］。

本文首次研究了黃花列當70%乙醇粗提物和不同萃取部位對［DPPH·］自由基的清除作用。自由基包括活性氧類，存在于體內外，是生物體正常代謝中形成的，影響著各種生理活性。生物體內過量的氧自由基會導致一系列疾病，如血管粥樣硬化、高血壓、糖尿病、癌癥、帕金森病及老年癡呆癥等。所以能消除活性氧的抗氧化劑受到了人們更多的關注。一些蒙醫藥藥治病的機理也被認為與其抗氧化活性有密切關系。

DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)通常被用來檢測抗氧化劑的抗氧化活性［3-6］。［DPPH·］是一種穩定的有機自由基，它的穩定性主要來自共振穩定作用及3個苯環的空間障礙，而使夾在其中氮原子上的不成對電子不能發揮其應有的電子成對作用。［DPPH·］在517nm波長處有強吸收峰，溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關系。當在溶液中有自由基清除劑存在時，清除劑提供的質子會和［DPPH·］結合形成［DPPH·-H］或發生替代，使［DPPH·］自由基數量減少，從而使溶液顏色由紫色變為黃色，表現為在517nm處的吸光度不斷減小。借此可以用來表征某種物質對自由基的清除能力。一般用IC50值來評價此物質抗氧化活性的大小。IC50值越小，表示該物質清除［DPPH·］性越強。本實驗研究了黃花列當對［DPPH·］自由基的清除作用，為其進一步深入研究利用提供了一定的理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑:黃花列當藥材于2010年3月購自內蒙古自治區中蒙醫院蒙藥房;自由基DPPH(Sigma Aldrich公司生產);抗壞血酸(天津市科盟化工工貿有限公司);所用溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備:OSB-2100型旋轉蒸發儀(東京理化);KQ3200DE型數控超聲波清洗器〔昆山市超聲儀器有限公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);DGG-9070B型電熱恒溫鼓風干燥箱;電子天平(YP5001N);分析天平(梅特勒 -托利多AL204);凍干機(基因有限公司)。

2 實驗方法

2.1 提取部位制備:干燥的黃花列當4 kg粉碎，70%乙醇回流提取2次，合并藥液，回收乙醇，得到70%乙醇總提物(hh4)，浸膏加入適量水混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，揮干，得乙酸乙酯部位(hh1)浸膏146.9g、正丁醇部位(hh2)浸膏185.5g和水(hh3)部位420.8g。4部位樣品均取部分冷凍干燥，備用。

2.2 溶液配制

2.2.1 ［DPPH·］溶液的配制:精確稱取 DPPH 粉末2.0 mg，用乙醇溶解，定容，配成 0.01mg·mL-1的 DPPH 無水乙醇溶液，置于冰箱內在4℃下避光保存，待用。

2.2.2 對照品 Vc的配制:精確稱取 Vc粉末2.5mg，用乙醇溶解后轉移至50ml容量瓶內，定容，搖勻得質量濃度為0.05 mg·mL-1的 Vc 對照品溶液;依次稀釋為 0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1的溶液;置于冰箱內在4℃下避光保存，待用。

2.2.3 樣品溶液的配制:精密稱取約 2.5mg的 hh1、hh2、hh3和 hh4凍干粉末，分別用乙醇溶解后，配成0.05mg·μmL-1的溶液;依次稀釋為 0.01mg·μmL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg· μmL-1、0.05mg·μmL-1的溶液;置于冰箱內在4℃下保存，待用。

2.3 清除［DPPH·］自由基能力的測定

2.3.1 對照品Vc的測定:吸取無水乙醇0.1mL與4.9mL的［DPPH·］溶液(0.01mgμmL-1)在試管中混合，搖勻后迅速倒入石英吸收池中，以無水乙醇作空白，立即用紫外可見分光光度計在517nm處測定吸光度，此時的數據為Aj。

依次吸取質量濃度為 0.01 mg·mL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg·μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的Vc 對照品溶液0.1ml分別與4.9ml［DPPH·］溶液(0.01mg·μmL-1)在試管中混合，搖勻后迅速倒入石英吸收池中。以0.1mLVc對照品溶液和4.9mL無水乙醇的混和后作空白，立刻用紫外可見分光光度計在517nm處測定吸光度，第 0、1、2、3、4、5min 分別測一次吸光度(若每分鐘吸光度值改變不超過0.003個單位則停止測量)，之后每隔5min測一次吸光度，直到30min時結束，此時的數據為Ai。

2.3.2 樣品的測定:分別依次吸取質量濃度為0.01mg·μmL-1、0.02mg· μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的 hh1、hh2、hh3、hh4 樣品溶液按上述方法與DPPH反應，并測定Ai。

2.3.3 計算清除率:按公式計算對照品和各樣品對［DPPH·］自由基的清除率(I)。

I=［1-(Ai/Aj)］ ×100%

3 結果與討論

以清除率(%)為縱坐標，樣品溶液的質量濃度(mgμmL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線計算IC50(mgμmL-1)值。結果見圖1和表1。

圖1 彎管列當各提取部位對DPPH·的清除能力

表1 黃花列當各提取部位對DPPH·的清除作用

由圖1、表1可知，黃花列當4個組分對DPPH·的清除能力隨各組分濃度的增大而增強。從回歸方程得各組分的IC50值(mgμmL-1)從小到大依次為:對照品 Vc(0.0718)＜乙酸乙酯部位(0.0997)＜正丁醇部位(0.1284)＜70%乙醇總提物(0.1732)＜水部位(0.4538)。

以維生素C作為對照品，結合［DPPH·］法評價黃花列當提取物的抗氧化活性。實驗結果表明黃花列當各萃取組分都具有不同程度的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的清除［DPPH·］自由基活性最強，正丁醇部位也有較好的清除［DPPH·］自由基活性，水部位的清除［DPPH·］自由基能力較弱。這個結果初步證實傳統藥物黃花列當具有很強的抗氧化活性，應用前景十分廣闊，為蒙醫臨床提供了有力證據。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1990，69:113-114.

［2］內蒙古植物藥志編輯委員會.內蒙古植物藥志，第五卷［M］.呼和浩特:內蒙古人民出版社，1980:311.

［3］曲歡歡，李白雪，燕菲，等.用清除有機自由基DPPH法評價連翹不同部位抗氧化作用［J］.中國中醫藥信息雜志，2008，15(增):32-34.

［4］王晶，李麗，劉春明，等.不同紅藥提取物中總酚的測定及抗氧化活性的DPPH法評價研究［J］.遼寧中醫雜志，2011，38(3):513-515.

［5］關立立，侯微，金銀萍，等.干玉竹根與鮮玉竹根萃取組分清除DPPH·活性比較［J］.特產研究，2011，(1):42-58.

［6］袁亞男，陳承瑜，楊濱，等.31種黃酮、酚酸類化合物和10種中藥清除 DPPH能力考察［J］.中國中藥雜志，2009，34(13):1695-1700.