西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內質網應激減輕大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷*

王 琛，李玉珍，王曉礽，呂振嶸，史大卓△，劉秀華△

(1中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091;2解放軍總醫院病理生理研究室，北京 100853)

上世紀九十年代以來我國對西洋參莖葉化學成分和藥理學作用進行了大量研究，表明其化學成分包括皂苷類、氨基酸類、糖類、揮發油類、無機元素類和脂肪酸類等，西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)是從西洋參莖葉中提取出的活性成分。研究顯示，PQS具有抗缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌細胞凋亡、抗心律失常、改善梗死后心室重構、增強抗氧化酶活性、減輕缺血所致的游離脂肪酸代謝紊亂和乳酸堆積、維持細胞內Ca2+穩態等作用［1-4］。內質網 (endoplasmic reticulum，ER)是細胞加工蛋白質和貯存Ca2+的主要場所，缺血缺氧、葡萄糖/營養物質匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產生及Ca2+穩態破壞等均可引起ER功能障礙，觸發內質網應激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)。持續而嚴重的ERS可通過鈣超載、影響線粒體功能等加重細胞凋亡和I/R損傷［5-6］，表現為ERS標志分子葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、鈣網蛋白 (calreticulin，CRT)的表達及ERS相關細胞凋亡途徑［C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、caspase-12等］的激活。PQS是否通過抑制過度的ERS，發揮抗心肌I/R損傷的作用，以往尚缺乏研究。本研究利用乳鼠心肌細胞缺氧/復氧 (hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，觀察PQS對心肌細胞損傷的保護作用，并通過ERS探討PQS抗心肌缺血再灌注損傷的相關保護機制。

材料和方法

1 動物與試劑

清潔級SD 24 h內新生乳鼠由軍事醫學科學院實驗動物中心提供;PQS粉由吉林省集安益盛藥業股份有限公司提供;DMEM培養基購自Gibco;新生牛血清 (newborn calf serum，NCS)購自PAA;胰蛋白酶(trypsin)購自Amresco;蛋白酶抑制劑購自Sigma;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物工程公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydogenase，LDH)測試盒購自南京建成生物工程研究所;TRNzol-A+總RNA提取試劑、2×Taq PCR Master Mix和電泳級瓊脂糖購自北京天根生化科技有限公司;cDNA第1鏈合成試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;PCR引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成;蛋白電泳分子量 (7～175 kD)標記為Bio-Rad產品;兔抗人CRT、caspase-12和GRP78多克隆抗體購自Stressgen;兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體和兔抗人Bax、Bcl-2多克隆抗體均購自Cell Signal;增強化學發光(ECL)試劑盒購自Millipore;辣根過氧化酶標記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz。

2 乳鼠心肌細胞培養

參照Simpson等［7］加以改進，無菌操作取出生后24 h內SD新生乳鼠心尖部組織，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15% 胰蛋白酶，37℃水浴下輕柔攪動、反復消化，制備心肌細胞懸液，差速貼壁。用含15%新生牛血清的DMEM培養液，調整細胞濃度為每瓶3×106，接種于底面積為75 cm2的培養瓶，置CO2孵箱進行原代培養。

3 實驗分組

取原代培養心肌細胞，置于CO2孵箱常規培養24 h，換無新生牛血清的DMEM培養液同步化24 h后，進行如下2個部分研究。為證明PQS對H/R心肌細胞的保護作用分為以下3組:正常對照 (control)組:細胞置CO2孵箱37℃，常規培養至實驗結束;H/R組:按Li等［8］將細胞置于缺氧倉內，通入95%N2-5%CO2混合氣，缺氧4 h后放回CO2孵箱，37℃常規繼續培養12 h結束實驗;PQS+H/R組:以PBS緩沖液稀釋PQS原粉，配成濃度分別為20、40、80、160 g/L的儲存液，過濾除菌，4 ℃保存，應用時將儲存液1000倍稀釋加入心肌細胞培養液中，培養24 h，進行H/R操作，根據預實驗結果(見圖1)，選取終濃度為160 mg/L為最佳給藥濃度。為進一步探討PQS對H/R心肌細胞保護作用的機制，又分為以下4組:正常對照組、H/R組和H/R+PQS組，處理同上;PQS組，細胞置CO2孵箱37℃常規培養16 h，然后加入160 mg/L的PQS水溶液，繼續培養24 h。

4 凋亡率、LDH漏出及細胞存活率測定

實驗結束時，收集各組細胞培養液，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液制備單細胞懸液，按照測試盒方法分別加入染料Annexin V和溴化丙啶(propidium lodide，PI)，室溫下孵育5 ～15 min，以流式細胞儀(BD FACScalibur，Becton-Dickinson)檢測細胞凋亡情況，以臺盼藍排斥實驗［9］測定細胞存活率，按LDH測試盒方法檢測細胞培養液中LDH活性。

5 RT－PCR測定

TRNzol-A+提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量。按cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟將RNA反轉錄成cDNA，進行PCR擴增。各目的基因上、下游引物見表1。采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析條帶平均吸光度值 (A)，以目的片段和GAPDH的平均光密度比值反映目的基因mRNA水平。

Figure 1.Panax quinquefolium saponin(PQS)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.A:flow cytometric images;B:apoptotic rates of cardiomyocytes in different groups..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖1 流式細胞術分析PQS對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響

表1 PCR反應中目的片段引物Table 1.Primer sequences used in PCR

6 Western blotting分析

按Liu等［10］報道方法提取心肌細胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，-80℃保存。取上述細胞蛋白提取液上清(含蛋白80 μg)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉40 min后分別加入 CRT、GRP78、caspase-12、Bcl-2、Bax多克隆抗體(均為1∶500)、CHOP 單克隆抗體 (1∶500)4℃過夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相應的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH(1∶500)單克隆抗體重復上述實驗過程，作為上樣對照。化學發光ECL顯示，采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值(integrated A value，IA，平均吸光度值×面積)，以靶蛋白/GAPDH IA比值反映靶蛋白水平。

7 統計學處理

采用SAS 8.2統計軟件對實驗數據進行分析，數據用均數±標準差()表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)進行多組間比較，采用q檢驗進行多組間兩兩比較，兩變量相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 西洋參莖葉總皂苷對H/R心肌細胞的保護作用

1.1 心肌細胞凋亡率 正常對照組細胞生長狀態良好，細胞凋亡率為2.12%;H/R組細胞凋亡率為7.09%(P ＜0.05);分別以 20、40、80、160 mg/L PQS培養細胞24 h，細胞凋亡率分別為4.2%、3.5%、3.2%和2.9%，P＜0.05，呈劑量依賴性，見圖1。

1.2 細胞培養液LDH活性 正常對照組細胞生長狀態良好，細胞培養液LDH活性為113.4 U/L，H/R組細胞膜通透性增高，培養液LDH活性較對照組升高約6倍 (P＜0.05)，以160 mg/L PQS培養液培養細胞24 h，其細胞培養液LDH活性較H/R心肌細胞培養液降低了66.58%(P＜0.05)，見表2。

1.3 細胞存活率 臺盼藍排斥實驗結果顯示，正常對照組細胞存活率為96.3%，H/R組細胞存活率較對照組降低21.7%(P＜0.05)。以160 mg/L PQS培養液孵育細胞24 h，其細胞存活率較H/R心肌細胞升高了21.1%(P＜0.05)，見表2。

1.4 凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達 RT-PCR的結果顯示，H/R組Bcl-2 mRNA的表達較對照組降低44.5%(P＜0.05)，BaxmRNA的表達較對照組升高86.9%(P＜0.05)，提示H/R可誘導抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax mRNA的表達。PQS可誘導H/R后抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達，PQS+H/R組心肌細胞Bcl-2 mRNA表達較H/R組升高30.9%(P＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax mRNA的表達，Bax mRNA表達較H/R組降低39.7%(P＜0.05)，見圖2A、B。

表2 PQS預處理對H/R后細胞存活率及LDH活性的影響Table 2.Effect of PQS preconditioning on survival rates and LDH activity of cardiomyocytes after H/R(.n=4)

表2 PQS預處理對H/R后細胞存活率及LDH活性的影響Table 2.Effect of PQS preconditioning on survival rates and LDH activity of cardiomyocytes after H/R(.n=4)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.H/R:hypoxia/reoxygenation;PQS:Panax quinquelium saponin.

Group Cell survival rate(%) LDH activity(U/L)Control 96.29±0.79 113.40±11.87 H/R 75.36±2.32* 671.33±46.62*160 mg/L PQS+H/R 95.47±0.53# 224.33±22.57*#

Western blotting的結果顯示，H/R組Bcl-2蛋白表達較對照組降低58.3%(P＜0.05)，Bax蛋白表達較對照組升高167.0%(P＜0.05)，提示H/R可誘導抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax蛋白表達。PQS可誘導H/R后抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，PQS+H/R組心肌細胞Bcl-2蛋白表達較H/R組升高48.0%(P＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax的表達，較H/R組降低48.4%(P＜0.05)，見圖2C、D。

Figure 2.Panax quinquefolium saponin(PQS)reduced the expression of pro-apoptotic protein Bax and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:the levels of Bcl-2 and Bax mRNA were examined by RT-PCR.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:the levels of Bcl-2 and Bax protein were examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖2 PQS對H/R心肌細胞Bcl－2和Bax表達的影響

2 西洋參莖葉總皂苷對H/R心肌細胞內質網應激相關分子表達的影響

2.1 GRP78、CRT mRNA和蛋白表達的變化 RTPCR的結果顯示，H/R可明顯誘導GRP78和CRT mRNA的表達，較對照組分別高380.0%和96.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R誘導的GRP78和CRT mRNA的表達，PQS+H/R組較H/R組分別降低61.6%和35.7%(P＜0.05)。Western blotting的結果顯示，H/R可明顯誘導GRP78和CRT蛋白的表達，較對照組分別升高142.0%和312.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R誘導的GRP78和CRT蛋白表達，較H/R組分別降低37.7%和52.2%(P＜0.05)，見圖 3。

2.2 CHOP mRNA和蛋白表達的變化 RT-PCR的結果顯示，H/R可明顯誘導心肌細胞CHOP mRNA的表達，較對照組高311.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R后的CHOP mRNA表達，PQS+H/R組心肌細胞CHOP mRNA表達較H/R心肌細胞降低57.0%(P＜0.05);Western blotting結果顯示，H/R可明顯誘導CHOP蛋白表達，較對照組升高219.0%(P＜0.05);PQS抑制H/R后的CHOP蛋白的表達，PQS+H/R組心肌細胞CHOP蛋白表達較H/R組降低51.7%(P ＜0.05)，見圖4A、B。

Figure 3.Effect of Panax quinquefolium saponin(PQS)on the expression of GRP78 and CRT in H/R-treated cardiomyocytes.A:the levels of GRP78 and CRT mRNA were examined by RT-PCR.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:the levels of GRP78 and CRT protein were examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖3 PQS對H/R心肌細胞GRP78、CRT表達的影響

2.3 Capase-12蛋白表達的變化 采用可同時識別caspase-12酶原(pro-caspase-12，分子量約48～50 kD)和剪切后的caspase-12(cleaved caspase-12，分子量36 kD)的特異性抗體，進行免疫印跡檢測，結果顯示H/R可明顯誘導caspase-12蛋白剪切活化，較對照組升高180.0%(P＜0.05);PQS抑制H/R后caspase-12蛋白活化，以160 mg/L PQS培養液培養24 h，剪切后caspase-12蛋白表達較H/R心肌細胞降低34.9%(P ＜0.05)，見圖4C、D。

3 CHOP蛋白表達與凋亡調節因子Bcl－2、Bax蛋白表達的相關性分析

相關性分析顯示，ERS凋亡分子CHOP蛋白表達與促凋亡因子Bax蛋白表達顯著正相關 (r=0.956，P＜0.05)，與抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達顯著負相關 (r=-0.967，P＜0.05)。

討 論

缺血再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)損傷指缺血一定時間的心肌恢復灌流后，組織損傷反而進行性加重，心肌細胞從可逆損傷轉變為不可逆損傷的現象。心肌細胞壞死和凋亡是心肌I/R損傷的特征之一［11］。Musat-Marcu 等［12］在離體灌流大鼠心臟上發現，再灌注早期即可發生心肌細胞凋亡。其中抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax參與了心肌I/R損傷中細胞凋亡的調控［13］。本研究利用乳鼠心肌細胞H/R模型，采用LDH活性檢測法、臺盼藍排斥實驗、流式細胞術以及RT-PCR和Western blotting方法，證實PQS能明顯減輕H/R誘導的心肌細胞損傷和凋亡。H/R前以160 mg/L PQS培養液培養細胞24 h，與H/R心肌細胞相比，細胞凋亡率、LDH活性以及促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白的表達均明顯降低，而細胞存活率及抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白的表達顯著升高。

Figure 4.Effect of Panax quinquefolium saponin(PQS)on the expression of the ERS-associated apoptotic protein CHOP and activation of the apoptotic effector enzyme caspase-12 in H/R-induced cardiomyocytes.A:the levels of CHOP mRNA and protein were examined by RT-PCR and Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:Western blotting analysis of caspase-12 activation in cardiomyocytes.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖4 PQS對H/R心肌細胞后CHOP表達的影響

I/R發生的主要環節是氧自由基產生和鈣超載，其機制尚未完全闡明，ER是調節Ca2+和蛋白質合成的重要場所，因此ER理化環境改變和ER過負荷等因素導致的ERS在I/R損傷的發生發展中具有重要意義［14-15］。ERS是細胞對刺激的適應性反應，一定程度的ERS誘導GRP78、CRT等內質網伴侶分子表達上調［16］，增強 ER處理未折疊蛋白的能力，促進ER功能恢復。但H/R觸發的嚴重ERS可顯著增加GRP78和 CRT的蛋白表達［17-18］，誘導 CHOP、caspase-12等促凋亡因子的表達及活化，觸發ERS相關凋亡途徑，誘導細胞凋亡和組織損傷［19-20］。本研究發現H/R前以160 mg/L的PQS培養液培養心肌細胞24 h，可顯著抑制H/R誘導的GRP78、CRT mRNA和蛋白表達，提示PQS可能通過減輕H/R誘導的嚴重ERS觸發的細胞凋亡，起到心肌保護作用;CHOP通過直接調節核內靶基因，增加細胞對ERS介導凋亡的敏感性，促進細胞凋亡［21］。CHOP介導的凋亡信號通路與線粒體凋亡途徑有密切聯系，CHOP可通過下調Bcl-2蛋白表達而促進細胞凋亡，并導致Bax從胞漿內向線粒體內易位［22］。本研究發現，H/R前以160 mg/L的PQS培養液培養心肌細胞24 h，可顯著抑制H/R誘導的 CHOP mRNA和蛋白表達;在此基礎上對CHOP蛋白表達與凋亡調節因子Bcl-2、Bax蛋白表達之間進行相關分析發現CHOP蛋白表達與Bax蛋白表達呈正相關，與Bcl-2蛋白表達呈負相關，提示CHOP介導的凋亡信號通路可能通過抑制Bcl-2和促進Bax蛋白表達，引起細胞凋亡，與以往文獻報道一致［23-24］，由此推測PQS可能通過抑制過度ERS介導的細胞凋亡起到心肌保護作用;caspase-12是內質網膜上的組成性蛋白，以無活性酶原形式存在于ER膜胞漿側，在ERS時被剪切激活，cleaved caspase-12通過激活caspase-9、caspase-3 引起細胞凋亡［25］，因而caspase-12被認為是內質網凋亡信號通路的關鍵分子。本研究發現，H/R明顯誘導心肌細胞cleaved caspase-12蛋白表達并引起細胞凋亡，與以往文獻報道一致［26］。H/R前以160 mg/L PQS培養液培養24 h，可顯著抑制H/R誘導的cleaved caspase-12的蛋白表達，提示PQS可能通過抑制caspase-12介導的內質網相關凋亡發揮心肌保護作用。

綜上所述，我們認為PQS通過抑制過度ERS發揮抗心肌細胞H/R損傷作用，表現為降低H/R誘導的 GRP78、CRT mRNA和蛋白表達，抑制 CHOP、caspase-12等內質網凋亡通路激活。但PQS對在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護作用尚待進一步研究。

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