大鼠血管外膜成纖維細胞亞群生長特性及功能研究*

劉 培，邵鐵梅，盧海剛，柴錫慶，高維娟，安勝軍

(河北化工醫藥職業技術學院，河北省高校生物反應器與蛋白類藥物開發應用技術研發中心，河北 石家莊 050026)

血管外膜成纖維細胞在血管新生內膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄病變中的重要作用引起了廣泛的重視［1－3］。隨著對細胞表面標記、結構蛋白及功能的研究，發現成纖維細胞是由許多具有獨特表型和功能的亞群組成［4］。Das 等［5］和 Stenmark 等［6］對牛肺動脈外膜成纖維細胞的相關研究也支持血管外膜成纖維細胞在形態及功能特性上有巨大的異質性。但是有關SD大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞亞群及其在血管功能中的比較研究目前尚未見報道。本實驗旨在獲得SD大鼠胸主動脈成纖維細胞亞群細胞系，并摸索其生長特性，比較血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)及其受體拮抗劑氯沙坦(losartan)和PD－123319對不同細胞亞群前內皮素原－1(preproendothelin－1，preproET－1)mRNA表達的影響，為在細胞水平研究血管新生內膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄機制提供充足可靠的靶細胞模型和一定的生理依據。

材料和方法

1 動物

SPF級SD大鼠，雄性，6～8周齡，購自河北醫科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(冀)2008－1－003。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Lonza BioWhittaker;DMEM/F12和0.25%胰蛋白酶購自Gibco;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Solarbio;Trizol購自Invitrogen;二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、Ang II、losartan 和PD－123319購自Sigma;dNTP、Taq DNA聚合酶購自Promega;所用引物由上海生工生物技術有限公司根據設計合成，見表1、2。

表1 RT－PCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT－PCR

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for fluorecent quantitative PCR

3 主要方法

3.1 血管外膜成纖維細胞亞群的分離與培養 SD大鼠斷頭處死，無菌條件下取胸主動脈，放入預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)中，清洗后于手術鏡下縱向剖開血管腔，刮去血管內膜和中膜，剩下薄層的血管外膜，轉移入含有20%FBS的DMEM/F12培養基中，剪成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，吸棄多余的培養基，將組織塊均勻鋪于培養皿上，置37℃、5%CO2培養箱干涸24 h，待組織塊貼壁后向培養皿中滴加少量含20%FBS的DMEM/F12培養基，置37℃、5%CO2培養箱中培養，次日補加適量培養液繼續培養，細胞生長達80%融合狀態時胰酶消化，并稀釋為5.0×104cells/L的細胞懸液，取1 mL該懸液補加5 mL新鮮培養液，吹打均勻后移入100 mm培養皿中培養，待細胞貼壁后換液，用記號筆在培養皿底部標記單個細胞，采用克隆環法［7］進行單克隆細胞培養，第3 d即可長出克隆集落，用胰蛋白酶消化傳至24孔板中擴大培養，逐步擴增細胞以獲得足夠的細胞量，實驗用細胞為第3～5代成纖維細胞亞群。

3.2 細胞純度鑒定 為了確認成纖維細胞亞群無內皮細胞、平滑肌細胞和白細胞的污染，采用RTPCR來鑒定，以β－肌動蛋白(β－actin)為內參照，von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)為內皮細胞標志物，肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和結蛋白(desmin)為平滑肌細胞標志物，CD8為白細胞標志物，設計并合成相關引物，引物序列及退火溫度見表1。分別提取大鼠血管外膜組織和成纖維細胞亞群RNA，經反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行梯度PCR，循環體系為1.25 U Taq聚合酶、20 mmol/L Tris－ HCl(pH 8.0)、50 mmol/L KCl、0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2和 0.02 μmol/L上、下游引物。循環程序如下:95℃初始化5 min，95 ℃ 1 min，46 ℃ ～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環，72℃ 10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙啶染色，凝膠成像系統捕獲圖像。

3.3 細胞生長曲線測定(MTT法) 血管外膜成纖維細胞亞群經胰酶消化后吹打均勻，調整細胞懸液濃度為1.0×107cells/L，接種于96孔板，每孔200 μL，每組8孔，其中包括3個平行對照孔(只加培養基，不加細胞)，每24 h測1組，連續7 d。具體操作如下:將96孔板于37℃、5%CO2培養箱中孵育。待細胞貼壁后饑餓24 h，使其生長同步化。每24 h向1組細胞中加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續孵育4 h后棄培養液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min使結晶物充分溶解，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值(A)，將平行對照孔調零，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

3.4 Ang II對成纖維細胞亞群preproET－1 mRNA表達的影響 采用熒光定量PCR檢測Ang II對成纖維細胞亞群preproET－1 mRNA表達的影響。取長至80%融合的細胞亞群，胰酶消化并計數，制備1.0×107cells/L細胞懸液，將細胞懸液種入6孔板中培養，待細胞長至80%融合后棄舊培養液，加入含100 nmol/L Ang II的新鮮培養液，分別于不同時點(0.5、1.0、1.5、3、6 和12 h)提取細胞亞群 RNA;進一步固定作用時間，用不同濃度 Ang II(0、10、100和1000 nmol/L)誘導各細胞亞群并提取RNA。

Ang II受體分為1型(angiotensin II type 1 receptor，AT1受體)和2型(AT2受體)，其拮抗劑分別為losartan和PD－123319。將80%融合的成纖維細胞亞群分為6組:空白對照組、losartan組、PD－123319組和Ang II(100 nmol/L)組、Ang II+losartan組和Ang II+PD－123319組。首先用100 μmol/L losartan或PD－123319預處理30 min，空白對照組不給予拮抗劑，之后加或不加Ang II(100 nmol/L)，繼續培養30 min后提取RNA。

采用Trizol法提取各組RNA，通過反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量PCR。循環體系中有SBGR Green(20×)，其余與RT－PCR相同，引物設計及退火溫度等見表2。循環程序如下:95℃初始化 2 min，95 ℃ 1 min，48 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共30個循環。以看家基因β－actin為內參照，采用Rotor－Gene 6000軟件進行數據分析，即以處理前細胞preproET－1和β－actin的比值為1，獲得各個preproET－1/β－actin的值。

4 統計學處理

統計學分析及圖形處理使用GraphPad Prism 5.0軟件，數據均用平均值±標準差()表示。各組間均數比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，兩兩比較采用LSD－t檢驗。

結 果

1 成纖維細胞亞群形態學觀察

克隆環法體外分離了120個血管外膜成纖維細胞亞群，倒置顯微鏡下觀察發現，這些細胞從形態上可分為2個亞群:圓形細胞亞群和紡錘形細胞亞群，見圖1。

Figure 1.Fibroblast subpopulations isolated from adventitia by cloning rings(×200).A:fibroblast subpopulation derived from adventitial fibroblasts demonstrated a epithelioid appearance，named round cells;B:subpopulation of adventitial fibroblasts appeared spindle shape，named spindle cells.The cells were isolated from 8 different SD rats.圖1 克隆環法獲得大鼠血管外膜成纖維細胞亞群

2 細胞純度分析

分別提取自圓形細胞和紡錘形細胞的RNA經反轉錄擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，圓形細胞和紡錘形細胞均無白細胞標志物CD8和內皮細胞標志物vWF的表達，平滑肌細胞標志物desmin和MHC亦未見表達;相同實驗條件下，血管組織中各標記物均表達，其中β－actin為內參照。這表明，本實驗經體外分離的圓形細胞和紡錘形細胞無白細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的污染，為純細胞系。

3 成纖維細胞亞群的生長特性

MTT法可以較準確地反映活細胞數，客觀地反映細胞的增殖情況。2個細胞亞群的生長趨勢有所不同，圓形細胞于第2 d進入指數分裂期，第4 d進入平臺期;紡錘形細胞于第3 d進入指數分裂期，第5 d進入平臺期，見圖3。

4 Ang II對成纖維細胞亞群preproET－1 mRNA表達的影響

Ang II(100 nmol/L)作用時間為0.5 h時，2個細胞亞群preproET－1 mRNA表達量最高，且無顯著差異，見圖4。但是從1 h開始，preproET－1 mRNA表達量明顯下降，呈衰減趨勢。選定作用時間0.5 h，繼續觀察不同濃度Ang II(0、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L)對preproET－1 mRNA表達量的影響。結果顯示:與自身對照組相比，Ang II呈濃度依賴性顯著增加圓形細胞preproET－1 mRNA的表達量(P＜0.01);而對紡錘形細胞preproET－1 mRNA表達量無顯著影響，見圖5。

Figure 2.Result of cell purity identification.Round cells and spindle cells derived from the aorta adventitia showed no expression fo von Willebrand factor(vWF，endothelial cell marker)，CD8(leukocyte marker)，desmin and myosin heavy chain(MHC，vascular smooth muscle cell marker).In contrast，the aorta had strong positive staining for vWF，CD8，MHC and desmin.Both cultured fibroblast subpopulations and aorta tissue expressed β － actin(housekeeping gene).圖2 細胞純度鑒定結果

Figure 3.Growth curves of fibroblast subpopulations.For round cells，the exponential phase of growth was from the 2nd day to the 4th day after passage;for spindle cells，the exponential phase of growth was from the 3rd day to the 5th day after passage.圖3 成纖維細胞亞群生長曲線

Figure 4.Effects of Ang II(100 nmol/L)on expression of preproET－1 in spindle cells and round cells for various time..n=3.圖4 Ang II不同作用時間誘導成纖維細胞亞群preproET－1 mRNA的表達

Figure 5.Effects of Ang II on expression of prepro ET－1 in spindle cells and round cells.The cells were incubated with Ang II at various concentrations(0，10 nmol/L，100 nmol/L and 1000 nmol/L)for 0.5 h..n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 不同濃度Ang II對紡錘形細胞和圓形細胞preproET－1 mRNA表達的影響

圖6中，與對照組(Ang II組)相比，losartan預處理30 min后，顯著抑制Ang II誘導的圓形細胞preproET－1 mRNA的表達，而對紡錘形細胞preproET－1 mRNA的表達無明顯影響;PD－123319預處理30 min后，對圓形細胞和紡錘形細胞preproET－1 mRNA的表達均無明顯影響。無Ang II誘導的實驗組中，細胞preproET－1 mRNA的表達均無明顯變化，這說明Ang II誘導圓形細胞preproET－1 mRNA的表達是通過AT1受體介導的。

Figure 6.Effects of Ang II receptor inhibitors on Ang II－induced expression of preproET－1 mRNA in spindle cells and round cells.The cells were pre－incubated with losartan(100 μmol/L)，an AT1receptor antagonist，or PD －123319(100 μmol/L)，an AT2receptor antagonist，for 30 min.The cells were then incubated with or without Ang II(100 nmol/L)for 30 min..n=3.＊＊P ＜0.01 vs respective control cells.圖6 Ang II受體拮抗劑對preproET－1 mRNA表達的影響

討 論

血管由內膜、中膜和外膜構成，成纖維細胞是血管外膜的主要細胞成分［4］。傳統觀念認為，血管損傷的主要反應在中膜，以平滑肌細胞增生、遷移為顯著特征，對血管重構的研究多集中在中層平滑肌細胞上，而忽略了血管外膜改變在血管重構形成中的作用［8］。近年的研究結果指出外膜在血管功能中并非只起支持及營養作用。在血管損傷后，位于血管外膜的成纖維細胞由“靜止”狀態轉為“激活”狀態，遷移至內膜下區域并參與新生內膜形成［9］。

Das等［5］對新生牛肺動脈的研究表明，肺動脈外膜由很多表型各異的成纖維細胞亞群組成，牛肺動脈外膜成纖維細胞亞群的異質性表現在形態學、DNA合成、肌動蛋白表達量及表達形式等方面。成纖維細胞亞群的異質性在多種動物中均有體現，更重要的是，來自同一種動物的成纖維細胞亞群與來自其它動物的亞群具有驚人的相似性。該實驗結果與有關內皮組織和中層組織細胞異質性的報道相一致［10－12］。

本研究中，我們體外分離了SD大鼠血管外膜成纖維細胞亞群(圓形細胞亞群和紡錘形細胞亞群)，從形態上說明了成纖維細胞亞群的異質性，并鑒定了細胞純度，以排除內皮細胞、平滑肌細胞及白細胞的污染，結果表明2個細胞亞群均為血管外膜成纖維細胞的純細胞系。除形態上區分圓形細胞和紡錘形細胞，進一步采用MTT法，比較了2種細胞的增殖能力，根據各孔吸光度值與細胞活力的正比關系，間接反映了細胞的生長狀態，結果顯示2個細胞亞群的增殖能力略有差異，圓形細胞較紡錘形細胞早1 d進入指數分裂期。

外膜成纖維細胞在調節血管平滑肌功能中的作用目前尚不十分清楚。當前研究發現表明外膜細胞可能在血管損傷和高血壓中起重要作用。相比WKY鼠胸主動脈血管外膜成纖維細胞，自發性高血壓大鼠的成纖維細胞有更高的增殖能力。這些發現說明在血液動力學和組織水平，ET－1有利于Ang II參與的血管作用。且有報道指出在鼠成心肌纖維細胞［13］和主動脈平滑肌細胞［14］中Ang II能誘導的 ET－1表達。我們前期的研究亦證明血管外膜成纖維細胞能夠合成和釋放ET－1［15］。在Ang II刺激下，成纖維細胞培養液中ET－1的分泌呈時間和劑量依賴性，成纖維細胞能夠表達preproET－1 mRNA，蛋白質斑跡法檢測其蛋白的表達與mRNA水平趨勢一致，據此我們推測外膜源性的ET－1的分泌參與了血管損傷及修復過程。外膜ET－1在吸引白細胞滲透方面也扮演重要角色。研究顯示高血壓在某種程度上是由炎癥引起的。C反應蛋白是炎癥的標志，在高血壓患者體內該蛋白明顯增多，C反應蛋白水平亦是高血壓并發癥的一個很好的指標。ET－1能促進炎癥細胞浸潤，導致醛固酮依賴性高血壓患者腎臟組織損傷。另外，在局部缺血再灌注誘導的黏膜功能障礙中，ET－1參與多形核白細胞的滲透。因此，Ang II誘導ET－1的釋放在細胞外基質調節中的作用以及外膜ET－1的其它作用很重要。本文就成纖維細胞的2個亞群的細胞功能進行了比較研究。在(0～1000)nmol/L濃度范圍內，Ang II濃度依賴性地增加了圓形細胞preproET－1 mRNA的表達，而對紡錘形細胞內preproET－1 mRNA的表達無顯著影響，該結果顯示Ang II誘導圓形細胞prepro-ET－1 mRNA的表達是通過AT1介導的，AT1拮抗劑losartan阻斷了Ang II誘導ET－1表達量的增加。

綜上所述，本研究成功分離了SD大鼠血管外膜成纖維細胞亞群，比較了2個亞群的增殖能力，并分析了Ang II對2個細胞亞群preproET－1表達的影響。為從細胞分子水平研究心血管疾病病因、機制和防治奠定了基礎。據此我們推測成纖維細胞的2個亞群在遷移能力、表型分化及肌動蛋白表達等功能特性上亦存在差異，可能不同程度地參與新生內膜的形成和血管重構等過程，具體作用機制有待進一步探討。

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