大鼠部分肝切除術后Hedgehog信號分子的表達*

金 海，劉慧玲，李學俊，馮智英，王 冰，楊建旭，汪根樹△，吳 斌

(中山大學附屬第三醫院1肝臟移植中心，中山大學器官移植研究所，廣東省器官移植中心，2消化內科，3肝病內科，4病理科，廣東 廣州 510630)

Hedgehog(Hh)信號通路是動物發育過程中重要的細胞間通訊，可調節許多成體組織器官干細胞的自我更新與增殖，維持正常的組織器官形態和功能。在組織器官損傷時Hh信號通路被激活，促進組織干細胞的分化和增殖以修復損傷。對人和鼠的研究顯示，多種肝臟損傷時出現Hh信號通路相關蛋白表達，提示Hh信號可能被激活，通過刺激肝臟干細胞分化增殖以修復肝臟損傷［1－2］。Hh信號通路是否參與了部分肝臟切除術后的肝再生罕有研究報道。本研究建立大鼠部分肝臟切除術模型，檢測術后肝臟Hh信號通路相關蛋白Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和 Glioblastoma－2(Gli－2)的表達，探討Hh信號通路在部分肝臟切除術后肝再生中的作用。

材料和方法

1 材料

清潔級健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只，重200～250 g，購自中山大學動物實驗中心。主要試劑和儀器包括:二步法抗兔/鼠通用型Ki－67免疫組化檢測試劑盒(GK500705，基因科技公司)，鼠來源Shh單克隆抗體(s8321，Sigma)，兔來源Ihh單克隆抗體(ab52919，Abcam)，兔來源 Gli－2多克隆抗體(sab2900411，Sigma)，倒置顯微鏡和照相系統(Leica)。術前禁食12 h，禁水4 h。

2 方法

2.1 大鼠部分肝切除模型的建立 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內注射麻醉大鼠，固定，腹部備皮，Ⅲ型安爾碘消毒腹部，取中上腹部正中切口，切開腹壁各層，切斷肝周韌帶，充分暴露肝臟，先用7－0絲線結扎各肝葉Glisson系統，然后用3－0絲線結扎肝蒂后切斷肝葉。切除肝左內側葉、左外側葉、中葉，約占大鼠全肝重量的70%。腹部給予2～3 mL生理鹽水補充術中失水，然后用3－0絲線連續縫合腹部切口關腹。術后保暖，單籠飼養，自由飲水進食。

2.2 實驗分組和標本采集 18只SD大鼠隨機均分為3組:假手術組(A)、部分肝切除術組1(B)、部分肝切除術組2(C)。A、B組于術后24 h、C組于術后48 h按照前述方法開腹切取肝組織。取材方法:小心取下剩余肝葉(右外葉、三角葉和乳頭葉)，用溫生理鹽水沖洗3次，分成均衡的兩部分，一部分用4%中性福爾馬林固定，另一部分用凍存管裝好保存在液氮罐內。

2.3 檢測指標和檢測方法 檢測指標包括肝組織HE染色和肝組織 Ki－67、Shh、Ihh、Gli－2的表達。肝組織切片行常規蘇木素和伊紅染色法檢測組織病理損傷，由專業病理科醫師進行結果判斷;肝組織Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2的表達采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結法檢測(免疫組化法)和 Western blotting法。Ki－67、Shh、Ihh 和 Gli－2免疫組化陽性結果判斷:細胞質(Shh、Ihh)或細胞核(Ki－67、Gli－2)呈現棕褐色顆粒狀染色為陽性反應。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。

結 果

1 肝組織HE染色

HE染色顯示A組肝細胞和肝小葉形態結構正常;B組可見肝竇擴張淤血和肝細胞水腫，并可見點狀壞死，肝索、肝小葉結構基本正常;C組除肝竇擴張淤血、肝細胞水腫、點狀壞死之外，還可見肝索排列紊亂，肝小葉結構基本正常，另可見處于不同分裂期細胞，見圖1。

2 肝組織Ki－67、Shh、Ihh和 Gli－2的表達

用免疫組織化學法檢測肝細胞Ki－67的表達評估各組術后肝臟的再生情況。B、C組Ki－67表達明顯高于 A組(P＜0.01)，C組高于 B組(P＜0.01)，見圖2、表1。用免疫組織化學法檢測肝細胞Shh、Ihh和Gli－2的表達評估術后各組肝臟Hh信號通路的表達情況。B、C組Shh、Ihh和Gli－2表達高于A組(P＜0.01)，C組高于B組(P＜0.01)，見圖3、表1。用Western blotting法檢測肝組織中Shh、Ihh的表達情況，其結果與免疫組化結果一致，見圖4。各組別數據顯示Shh、Ihh和Gli－2表達強度與肝臟細胞增殖程度一致。

Figure 1.HE staining of rat liver tissues in each group(×400).A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖1 各組別HE染色結果

Figure 2.A proliferation marker，Ki－67，was evaluated using immunohistochemistry in each group(×400).Ki－67 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖2 增殖細胞標志物Ki－67在各組的表達情況

Figure 3.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)and Hh transcription factor(Gli－2)in rat livers in each group(×400).Shh，Ihh and Gli－2 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖3 各組Shh、Ihh和Gli－2的表達情況

表1 各組Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2陽性細胞數Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

表1 各組Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2陽性細胞數Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

Fifteen randomly－chosen fields(×400)in each section were evaluated.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).＊＊P ＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.

Group Ki－67 Shh Ihh Gli－2 A 4.17±1.47 6.17±1.47 11.83±1.94 6.83±1.60 B 14.33±2.25＊＊ 10.17±1.72＊＊ 20.17±1.17＊＊ 27.83±6.74＊＊C 115.00±4.56## 30.50±1.64## 38.17±4.12##67.50±12.11##

Figure 4.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)examined by Western blotting in rat livers in each group.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(48 h);C:partial hepatectomy(24 h).圖4 各組Shh和Ihh的表達情況

討 論

Hh信號通路［3］由Hedgehog配體、2個跨膜蛋白受體Patched(Ptch)和 Smoothened(Smo)，以及下游轉錄因子Gli蛋白等組成。在哺乳動物中存在3種Hh成員，即 Shh、Ihh 及 Desert Hedgehog(Dhh)，均為分泌性蛋白。Ptch和Smo是位于細胞膜上的跨膜蛋白，其中Ptch為Hedgehog的受體，能與3種Hh蛋白結合。當不存在Hh蛋白時，Ptch抑制Smo的活性進而抑制下游基因的轉錄表達。當Hh蛋白與Ptch結合時，Ptch對Smo的抑制效應被解除，激活下游的轉錄調節因子Gli，即可誘導目標基因的表達。Hh信號通路可調節許多成體組織器官干細胞的自我更新與增殖，維持正常的組織器官形態和功能。

對人類原發性膽汁性肝硬化、酒精性肝病和對大鼠膽管結扎、酒精性和非酒精性脂肪肝、乙硫氨酸中毒肝臟以及缺血再灌注肝臟模型的研究［4－6］顯示，各種肝臟損傷時肝臟組織中出現Hh信號通路相關蛋白和肝臟干細胞標志物表達，推測肝損傷時Hh信號通路可能被激活，通過刺激肝干細胞和肌纖維母細胞的分化和增殖以修復肝臟損傷。體外實驗發現Shh可以抑制小管細胞凋亡，Hh信號通路抑制劑可以抑制培養的肝母細胞瘤的生長［7］。

在部分肝切除術后肝臟組織缺損，肝再生可以部分或全部恢復肝臟原來體積和形狀，其中包括肝細胞、膽管和血管等組織的再生修復。在活體部分供肝移植和劈離式肝移植術后［8］，移植肝臟通常能迅速再生，部分或全部恢復肝臟原來體積和形狀。肝臟這種再生修復組織缺損的機理尚不明確。較早的研究認為肝損傷后肝再生要依賴于分化成熟的肝細胞重新活化增殖。肝臟損傷后可分泌相關調控因子(如 tumor necrosis factor α、interleukin － 6、cyclin D1、immediate early gene、hepatocyte growth factor等)刺激肝細胞再活化增殖，修復損傷［9－11］。目前認為肝損傷是由肝干細胞增生和分化來修復的。肝干細胞是肝組織中具有自我更新和分化為肝細胞、膽管上皮細胞等多種細胞的不成熟細胞，在生理條件下負責更新衰老死亡的肝組織細胞，維持肝臟結構和功能的完整性;在病理條件下如肝組織缺損、細胞壞死等，肝干細胞可增生和分化修復肝損傷。成年肝臟上皮祖細胞為Hh反應細胞。胚胎期和成年靈長類肝臟的各型上皮祖細胞都能產生Hh配體或對之應答。

本實驗顯示在部分肝切除術后，殘肝組織中出現細胞水腫和壞死，至48 h可見處于不同分裂期細胞，細胞增生標志物Ki－67開始表達，說明肝臟干細胞開始增殖以修復肝組織缺損。本實驗還顯示在部分肝切除術后，殘肝組織中可見 Hh信號蛋白Shh、Ihh和Gli－2的表達，且它們的表達強度與肝細胞增生標志物Ki－67的表達程度一致。提示在部分肝切除術后Hh信號通路被激活，可能誘導肝臟干細胞分化和增殖，修復肝臟缺損。這與Ochoa等［11］報道Hh信號通路在部分肝切除術后激活并可能促進肝臟再生的結果一致。

［1］Omenetti A，Diehl AM.The adventures of Sonic Hedgehog in development and repair.II.Sonic Hedgehog and liver development，inflammation，and cancer［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294(3):G595 －G598.

［2］Omenetti A，Choi S，Michelotti G，et al.Hedgehog signaling in the liver［J］.J Hepatol，2011，54(2):366 － 373.

［3］Choi SS，Omenetti A，Syn WK，et al.The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43(2):238 －244.

［4］Hirose Y，Itoh T，Miyajima A.Hedgehog signal activation coordinates proliferation and differentiation of fetal liver progenitor cells［J］.Exp Cell Res，2009，315(15):2648－2657.

［5］Witek RP，Yang L，Liu R，et al.Liver cell－derived microparticles activate Hedgehog signaling and alter gene expression in hepatic endothelial cells［J］.Gastroenterology，2009，136(1):320 －330.

［6］Yang L，Wang Y，Mao H，et al.Sonic Hedgehog is an autocrine viability factor for myofibroblastic hepatic stellate cells［J］.J Hepatol，2008，48(1):98 － 106.

［7］汪根樹，陳規劃，陸敏強，等.缺血預處理對大鼠小體積供肝一氧化氮合酶的影響及意義［J］.中國病理生理雜志，2006，22(11):2102 －2104.

［8］Fausto N.Liver regeneration and repair:hepatocytes，progenitor cells，and stem cells［J］.Hepatology，2004，39(6):1477－1487.

［9］Hooper JE，Scott MP.Communicating with Hedgehogs［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(4):306 －317.

［10］Selzner N，Selzner M，Tian Y，et al.Cold ischemia decreases liver regeneration after partial liver transplantation in the rat:A TNF－α/IL－6－dependent mechanism［J］.Hepatology，2002，36(4 Pt 1):812 －818.

［11］Ochoa B，Syn WK，Delgado I，et al.Hedgehog signaling is critical for normal liver regeneration after partial hepatectomy in mice［J］.Hepatology，2010，51(5):1712 －1723.