一氧化氮及一氧化氮合酶在急性吸入高濃度氧大鼠肺泡上皮細胞凋亡中的作用

周 海，潘曉軍，楊建平，郭成浩△

(1蘇州大學附屬第一醫院麻醉科，江蘇 蘇州 215006;2山東大學醫學院病理與病理生理學研究所，山東 濟南 250012;3徐州中心醫院麻醉科，江蘇 徐州 221009)

持續吸入高濃度氧通過體內出現的氧化應激產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，進而導致肺損傷已有較多報道［1］。我們發現大鼠在吸入高氧4 h后即發生體內抗氧化能力改變，引起肺組織出現形態變化，一定程度上解釋了臨床全麻期間病人雖短期持續吸入高濃度氧，仍會出現拔管困難的現象［2］。氧自由基及其衍生物與細胞凋亡(apoptosis)密切相關［3］，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)尤為重要。本實驗通過制備大鼠高氧肺損傷模型，觀察高氧急性期時血漿NO水平、肺泡上皮細胞凋亡及NO合酶(NO synthase，NOS)活性及內皮型 NOS(endothelium NOS，eNOS)和誘導型 NOS(inducible NOS，iNOS)蛋白表達情況，探討高氧急性期的各指標的關系以探討肺損傷的機制。

材料和方法

1 動物模型的制備

1.1 動物的選擇和分組 2月齡Wistar大鼠60只，體重150～200 g，由山東大學動物實驗中心提供。隨機分為5組:正常氧對照組、高氧4 h組、高氧8 h組、高氧12 h組、高氧16 h組，每組12只，雌雄各半。

1.2 動物模型的建立 采用聚乙烯箱和玻璃自制氧箱，尺寸為50 cm×30 cm×20 cm，為避免箱體內形成高壓，箱體前后設有進氣口和出氣口，應用氣體流量計測定調整進出口大小和氧氣流速，使氧箱進出氣流量相同。每2 h應用OX－100A型數字測氧儀檢測1次箱內氧濃度，使氧濃度保持在85%以上。箱內放置鈉石灰吸收CO2，保持CO2濃度不高于5%。對照組大鼠放置于敞開的未通入氧氣的氧箱中。保持實驗室溫度在20～28℃，每天白晝時間12 h，各組大鼠都給予充足的食物和飲水，保持墊料清潔。由于實驗用氧箱體積有限，每個箱中只能放置6只大鼠。

2 觀察指標和檢測方法

所有大鼠取標本前禁食6 h(不禁水)。將實驗動物腹腔注射麻醉藥物(氯胺酮0.1～0.15 mg/g、安定6～7.5 μg/g)，動物麻醉后立即解剖經腹靜脈抽取靜脈血5 mL放置抗凝試管中冷藏，3000 r/min離心10 min抽取血漿檢測。取大鼠左肺用4%中性甲醛液固定，右肺三葉稱重，按1∶10加入0.15 mmol/L的冰氯化鉀勻漿溶液，高速勻漿機制漿(FSH－2A，江蘇金壇市醫療儀器廠)，－4℃ 1500 r/min離心(GL－20高速冷凍離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)15 min后取上清液密閉保存在－20℃冰箱中待檢。

2.1 病理學檢查 24 h內進行石蠟包埋。常規制片，HE染色后鏡下觀察細胞病理學形態。按TACS原位凋亡測試試劑盒(TA4652，R＆B)說明制片，作TUNEL染色，光學顯微鏡下計數陽性細胞數，連續計數5個高倍視野。

2.2 丙二醛(malondialdehyde，MDA)、NO 含量和NOS活性測定 MDA測定試劑盒、NO測定試劑盒、NOS測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，操作方法按說明書。用AV640可見光分光光度儀(Olympus)化學比色檢測肺勻漿液、血漿中的MDA、NO和NOS活性。

2.3 不同類型的NOS含量測定 部分肺組織加入事先配置好的蛋白裂解液(RIPA+PMSF，PMSF最終濃度為1 mmol/L)，在冰上放置20～30 min后，以10000 r/min 4℃離心4 min，吸取上清(即所提取的總蛋白)檢測其濃度。采用聚丙烯酸銨凝膠電泳(SDS－PAGE)技術測定iNOS、eNOS的蛋白含量(轉膜儀，SDS－PAGE電泳儀為Bio－Rad產品)。常規制備凝膠并放入電泳槽中，檢測樣品量為30 μL(6 μL蛋白上樣緩沖液+24 μL總蛋白)，于100℃水浴鍋內變性5 min后，取出放涼后加入樣品孔。恒壓90 V開始電泳，待指示劑到達濃縮膠與分離膠交界處，將電壓提高至120 V。待指示劑到達膠底部時，停止電泳。將凝膠取出放置于轉膜緩沖液中。對照蛋白marker，將含有目的條帶和β－actin蛋白的凝膠切下，剪取與凝膠相同大小的PVDF膜，后者先用甲醇浸泡30 s，然后置于緩沖液中浸泡15 min。剪取4塊與凝膠大小相同的濾紙，于轉移緩沖液中浸泡15 min。按正極－濾紙－PVDF膜－凝膠－濾紙－負極的順序依次放置于半干轉膜儀上，電壓20 V，轉膜30 min。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉TBS液中于37℃封閉2 h。1∶1000稀釋抗β－actin單克隆抗體(武漢博士德公司)、1∶800稀釋的抗eNOS抗體和抗iNOS抗體(兔抗鼠，武漢博士德)和PVDF膜4℃下孵育過夜。充分洗膜3次后，將1∶5000稀釋的HRP標記的兔抗羊IgG 37℃孵育30 min。充分洗膜3次后，將PVDF膜取出放置在保鮮膜上。將2種顯色底物1∶1等體積混合后覆蓋在膜表面，用保鮮膜把膜包起來，放入暗匣中，在暗室中將X光片覆蓋在膜的表面，夾好暗匣，曝光后顯影、定影，觀察結果。由圖像分析系統(南京新飛達公司生產)，掃描測定吸光度(A)定量。

3 統計學處理

結 果

1 各組大鼠血漿、肺組織勻漿生化指標

與對照組比較，無論是血漿還是肺組織勻漿中，高氧各組MDA濃度、NO濃度和NOS活性均顯著升高(P ＜0.01)，見表1。

2 Western印跡及吸光度分析結果

eNOS在對照組明顯表達，高氧4 h組表達開始升高，8 h組后eNOS蛋白質表達升高明顯。對照組iNOS蛋白微量表達，但表達量遠低于eNOS，16 h組表達略增強，見圖1。

3 各組大鼠肺組織病理學變化

圖2顯示，高氧4 h組肺毛細血管有輕度充血和中性粒細胞滲出;8 h組可見肺毛細血管擴張，充血明顯，肺間質有大量炎性細胞滲出，肺泡腔有少量紅細胞滲出;12 h組肺小血管擴張、充血，肺泡腔內出現紅細胞及以中性粒細胞為主的炎癥細胞，肺組織水腫明顯，間質內細胞增多;16 h組可見肺大泡和肺不張，并存在肺組織結構紊亂，肺泡壁輕度增厚。

4 各組大鼠肺泡上皮細胞TUNEL染色切片

圖3顯示4 h組肺泡上皮細胞凋亡明顯增加，達9.13%±3.20%，表現為淺綠色的核背景下有棕褐色小顆粒或塊狀物，正常細胞核被染成淺綠色;8 h組、12 h組凋亡細胞增加更加明顯，達17.47% ±3.50%、19.22% ±4.50%。16 h組明顯下降至11.03% ±2.80%，其中12 h組和16 h組核內出現棕黃色團快，呈現DNA碎片凝集現象。各高氧組與對照組(凋亡細胞占2.17% ±1.80%)比較差異顯著(P ＜0.01)。

5 各組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細胞凋亡的線性相關分析

隨吸氧時間延長，各高氧組血漿及肺組織各指標與肺泡上皮細胞凋亡呈明顯的正相關，見表2。

表1 急性吸氧對大鼠血漿及肺MDA濃度、NO濃度和NOS活性的影響Table 1.MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues of the rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

表1 急性吸氧對大鼠血漿及肺MDA濃度、NO濃度和NOS活性的影響Table 1.MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues of the rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

MDA NO NOS Group Plasma(nmol/L) Lung(μmol/g protein) Plasma(μmol/L) Lung(mmol/g protein) Plasma(103U/L) Lung(103U/g protein)Control 4.43±1.77 1.87±0.51 16.01±2.43 5.17±1.43 16.01±2.48 0.94±0.13 Hyperxia 4 h 6.31±0.77＊＊ 3.24±0.43＊＊ 18.97±2.44＊＊ 12.00±2.51＊＊ 18.97±2.37＊＊ 1.77±0.34＊＊Hyperxia 8 h 9.43±1.34＊＊ 3.91±0.50 ＊＊ 21.04±4.75＊＊ 13.50±2.74 ＊＊ 20.17±3.22＊＊ 1.98±0.31＊＊Hyperxia 12 h 11.70±2.14＊＊ 4.81±0.50＊＊ 22.17±2.97＊＊ 14.90±3.52＊＊ 21.08±2.01＊＊ 2.24±0.45＊＊Hyperxia 16 h 13.67±1.83＊＊ 5.81±0.70 ＊＊ 22.89±3.01＊＊ 15.60±3.46＊＊ 21.84±1.97＊＊ 2.32±0.67＊＊

Figure 1.eNOS and iNOS expression in the lung of rats exposed to acute hyperoxia..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 急性吸氧大鼠肺組織eNOS和iNOS的表達

討 論

吸氧是臨床有效的治療手段，但長期應用會導致副作用的產生，應注意老幼病人的長期應用適應癥［1］。臨床吸氧濃度大于50%即稱為高濃度氧療［4］，特別臨床全麻期間病人需要持續吸入85% ～100%高濃度氧，麻醉吸氧時間雖不長，但有時會碰到不明原因的拔管困難病例，這使得我們考慮急性高氧吸入是否造成肺損傷問題，我們在前期工作發現急性高氧吸入4 h即可引起實驗大鼠的氧化水平異常并出現肺損傷［2］。

Figure 2.Pathological changes of lung tissues in rats exposed to acute hyperoxia(HE staining，×400).Control group:normal lung;hyperoxia 4 h group:mild pulmonary congestion;hyperoxia 8 h group:dilated pulmonary capillaries，obvious congestion，obvious neutrophilic exudate in the pulmonary interstitium and a few red cell exudate in the alveolar space;hyperoxia 12 h group:more red cell and neutrophilic exudate in the alveolar space;hyperoxia 16 h group:big bubble，atelectasis and mild alveolar wall thickening.圖2 急性吸氧大鼠肺組織病理變化

Figure 3.Apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(TUNEL，×400).圖3 急性吸氧大鼠肺泡上皮細胞凋亡的情況

表2 各高氧組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細胞凋亡的線性相關分析Table 2.Linear correlation coefficients between MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues，and apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

表2 各高氧組大鼠血漿及肺MDA、NO和NOS與肺泡上皮細胞凋亡的線性相關分析Table 2.Linear correlation coefficients between MDA concentration，NO concentration and NOS activity in plasma and lung tissues，and apoptosis of alveolar epithelial cells in rats exposed to acute hyperoxia(.n=12)

MDA NO NOS Plasma Lung Plasma Lung Plasma Lung Apoptosis 0.99 0.99 0.99 0.99 0.95 0.99

機體內活性氧－抗氧化系統平衡的破壞是高氧造成肺損傷的主要原因。NO既是一種生物信使分子和細胞毒性效應分子，又是重要的自由基。正常生理條件下，NO作為內皮舒張因子，參與組織和細胞的血液供應，但在氧化應急狀態下，NO可與SOD有力地競爭O2－而形成強氧化劑ONOO－，即NO+，ONOO－可使細胞內許多重要的蛋白質或酶失活，破壞線粒體結構，使DNA鏈斷裂，并可啟動脂質過氧化［3，6－7］，引起細胞壞死或凋亡。本實驗發現，高氧吸入4 h后，大鼠血漿及肺組織MDA、NO和NOS水平就出現異常，同時形態學研究發現肺泡上皮細胞凋亡開始增加，且具有隨吸氧時間延長肺組織形態變化加重的趨勢，在16 h后開始恢復。提示吸入高濃度氧4 h體內NOS活性即已上調，NO生成增加，說明吸氧早期NO平衡已打破，NO及其衍生物在誘導肺泡上皮細胞凋亡和其它肺部形態改變中可能發揮了重要的介導作用。有報道高氧通過MAPKs通路導致肺泡上皮凋亡［8］。

NO可由位于血管內皮的eNOS、白細胞的iNOS和神經元的nNOS合成并分泌，有研究發現高氧條件下3 d后小鼠肺內iNOS和eNOS表達及其活性上調，NO生成增加［5］，提示NO可能參與介導高氧性肺損傷。本實驗Western blotting結果顯示，正常肺組織主要表達eNOS，而iNOS較少表達;而高氧吸入4 h后，肺組織中主要是eNOS顯著升高，而iNOS變化不大，僅在16 h有輕微升高，說明在急性高氧吸入時肺中的NO來源還是以eNOS合成的NO為主。

但細胞遭受應激損傷時，并不一定耗盡了胞內的SOD等抗氧化劑，而是微妙地調節胞內的信號轉導途徑［8－9］，從而導致凋亡等細胞損傷出現。本實驗形態研究表明，在急性高氧刺激下，隨時間延續，肺組織表現為毛細血管擴張，通透性增加，伴有少量炎細胞滲出。細胞凋亡研究顯示，4 h組肺泡上皮細胞凋亡明顯增加;8 h組、12 h組凋亡細胞增加更加明顯。而16 h組細胞凋亡明顯下降，提示在急性高氧損傷過程中，在16 h時點細胞凋亡減少，可能是值得深入研究的問題。我們分析急性高氧不僅促進肺泡上皮細胞凋亡的增加，也促進肺毛細血管壁的通透性的增加，嚴重時可導致白細胞滲出，但并沒有到使白細胞功能激活的程度，因為iNOS并沒有很高的表達，肺部損傷病變處于容易恢復的狀態。同時機體有強大的調整能力，在16 h時，可能已經開始恢復。

本實驗采用的高濃度氧與全麻吸入氧濃度相同，吸氧4～8 h也與全麻時間接近。本實驗結果提示急性高氧肺損傷模型中NO及其衍生物在誘導肺泡上皮細胞凋亡和其它肺部形態改變中可能發揮了重要作用，同時提示臨床全麻期間吸入高濃度氧的安全性值得進一步研究。

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