長期甲狀腺素刺激對大鼠心肌Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的影響*

李 超，劉善紅，張家明，劉 敏，李景東

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心內科，湖北 武漢 430022)

甲狀腺素所致心肌肥厚的動物模型其血流動力學表現為心率加快、心輸出量增加、心肌收縮力增強及舒張期縮短，而上述病理生理變化都涉及心肌細胞內Ca2+釋放和重吸收平衡的改變。研究表明:甲狀腺素通過改變心肌細胞膜上的L型－鈣離子通道(L－type Ca2+channels，LTCCs)、肌漿網膜(sarcoplasmic reticulum，SR)上的Ca2+釋放通道即蘭尼堿受體2(ryanodine receptors，RyR2)、鈣 ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+－ATPase 2a，SERCA2a)與受磷蛋白(phospholamban，PLB)等通道蛋白的表達和活性，來影響SR 內 Ca2+釋放和重吸收平衡［1］;而 RyR2、SERCA2a、PLB 及LTCCs等上述通道蛋白均受Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的直接調節，過度表達CaMKⅡ的小鼠將引起心臟的結構和電重構［2］，提示心肌細胞內CaMKⅡ與心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的發生發展密切相關。作為參與細胞內Ca2+調控的重要信號分子，CaMKⅡ激活是否受甲狀腺素的影響，CaMKⅡ是否參與長期甲狀腺素刺激誘導的甲亢性心臟病的發生發展，目前國內外缺乏這方面的研究。本研究利用長期甲狀腺素刺激致大鼠心肌肥厚模型，觀察心肌CaMKⅡ的變化，為探討CaMKⅡ是否參與長期甲狀腺素刺激誘導的甲亢性心臟病的發生發展提供實驗依據;進而有可能用CaMKⅡ抑制劑來治療甲亢性心臟病。

材料和方法

1 材料

1.1 動物模型制備及分組 健康雄性SD大鼠20只，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，體重為180～210 g(196.5 g±7.3 g)。將SD大鼠隨機分為甲狀腺素刺激組和對照組，每組各10只，以0.2 mg·kg－1·d－1的劑量腹腔注射甲狀腺素或等體積生理鹽水3個月(每次給藥前稱體重)，均以標準飼料喂養。

1.2 試劑 甲狀腺素粉劑、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿(Sigma);大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco);BCA法試劑盒(Pierce);ECL發光試劑盒(Amersham);兔抗GAPDH抗體、山羊抗 CaMKⅡδ(A－17)抗體(Santa Cruz);兔抗CaMKⅡ(Thr286)抗體(Cell Signaling);辣根過氧化物酶標記的相應Ⅱ抗均購自武漢安特捷生物技術有限公司;Trizol、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由大連寶生物工程有限公司根據設計合成。

2 方法

2.1 心肌肥厚和纖維化測定 以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內注射麻醉大鼠，麻醉成功后仰臥位固定于動物手術臺上，沿胸骨左緣開胸迅速取出心臟，用PBS洗凈殘血、沿室間隔分離左右心室肌后，濾紙吸干后稱重并記錄心臟各部分重量。取部分左室中段橫截面心肌，常規制片后行HE染色，在顯微鏡下放大400倍拍照，每張切片隨機選取10個視野，每個視野選10個心肌細胞測量其橫徑大小并取其平均值反映心肌肥厚;常規制片后行Masson染色，在顯微鏡下心肌細胞呈紫紅色，膠原纖維呈藍色，采用Image－Pro Plus 6.0彩色病理圖文分析系統在膠原組織Masson三色染色下測量心肌血管周圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)和血管腔面積(vascular luminal area，VA)，以PVCA/VA作為心肌纖維化指標，每一標本取6條壁內小動脈橫切面進行測量，取其平均值反映心肌纖維化程度。

2.2 用實時定量RT－PCR法檢測心肌組織中CaMKⅡ mRNA的表達 利用Trizol法提取心肌組織中總RNA，然后通過常規反轉錄－擴增法檢測目的基因mRNA的表達。CaMKⅡ上游引物5'－AGAAGTTCAAGGCGACCAGCA －3'，下游引物5'－GGGTATCCCACCAGCAAGATGTAG－3';內參照基因GAPDH上游引物5'－CTATCGGCAATGAGCGGTTC－3'，下游引物5'－CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT－3'。用逆轉錄試劑盒制備cDNA后，取適量的cDNA進行PCR擴增，其反應條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min預變性，95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃45 s，共40個循環，72℃ 10 min。以熔解曲線和產物電泳結果判斷反應產物特異性。依據公式 ΔCt=Ct目的基因－Ct內參照基因求得兩組ΔCt，根據實時定量PCR原理，待擴增目的基因的Ct值與該基因的拷貝數呈反比，ΔCt值越大表明基因表達量越低，用2－ΔΔCt的方法求得CaMKⅡ mRNA的相對含量。

2.3 心肌組織中CaMKⅡ的表達與活性的檢測 取左室游離壁心肌組織100 mg左右剪碎，放入勻漿器中，加入1 mL裂解液(50 mmol/L Tris－HCl pH 7.5，100 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF，50 mmol/L NaF，50 mmol/L β －磷酸甘油，20 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L LR微囊藻素，20 mg/L大豆胰蛋白酶抑制劑，5 mg/L亮肽素)充分勻漿，4℃12000×g離心15 min，取上清分裝后置于－70℃保存。BCA法測定蛋白濃度后，每組取適量等量蛋白(約60 μg)加上樣緩沖液，PCR儀99℃10 min，使蛋白充分變性。采用9%SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS－PAGE)分離(100 V，120 min)蛋白，硝酸纖維素膜電轉印(300 mA，70 min)，麗春紅S液染膜，0.3%TBST液洗膜3 min×3次，5%脫脂奶粉封閉3 h后加入山羊抗CaMKⅡδ(A －17)抗體1∶200、兔抗 CaMKⅡ(Thr286)抗體 1∶500、兔抗GAPDH抗體1∶1000于4℃孵育過夜，TBST洗膜15 min×3次后加入相應Ⅱ抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜15 min×3次(CaMKⅡ磷酸化蛋白的Ⅰ抗和Ⅱ抗洗膜7 min×3次)，DAB顯色，用圖像分析系統(Gel－Pro Analyzer 4.0)對蛋白條帶進行半定量分析，用平均灰度值代表蛋白表達水平。

3 統計學處理

結 果

1 一般情況觀察

甲狀腺素刺激組造模3～7 d后大鼠開始出現食欲及活動明顯增強、煩躁不安、心率加快、體重增長速度減慢等表現。造模3個月后實驗組大鼠體重增加81.5 g±12.3 g，對照組大鼠體重增加248.5 g±14.2 g，差異顯著(P＜0.05)。

2 2組心肌肥厚和心肌纖維化程度比較

從圖1和圖2中可以明顯看出實驗組大鼠心肌纖維橫徑比對照組明顯增粗，并且左室心肌纖維化程度明顯增加。甲狀腺素刺激組大鼠的心重、心重/終體重、左心室重/終體重、左室心肌細胞橫徑及左室心肌纖維化程度(PVCA/VA)分別是正常組的1.17倍、1.87倍、1.84倍、2.15倍和1.94倍，見表1。

Figure 1.The comparison of left ventricular myocardial fiber diameter size(HE staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.圖1 左室心肌纖維橫徑大小的比較

Figure 2.The comparison of left ventricular myocardial fibrosis(Masson staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.圖2 左室心肌纖維化程度的比較

3 定時定量RT－PCR結果

甲狀腺素刺激組和對照組心肌細胞中CaMKⅡmRNA的相對表達量分別為0.28±0.19和1.60±0.45，甲狀腺素刺激組心肌細胞中CaMKⅡmRNA表達量是對照組的40%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖3。

表1 體重、心重及心肌細胞橫徑與心肌纖維化的變化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

表1 體重、心重及心肌細胞橫徑與心肌纖維化的變化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs control group.IBW:initial body weight;FBW:final body weight;HW:heart weight;LVW:left ventricular weight;MCD:myocardial cell diameter.

PVCA/VA Control 197.00 ±7.15 445.50 ±19.21 1.16 ±0.11 Group IBW(g) FBW(g) HW(g) HW/FBW(mg/g)LVW/FBW(mg/g) MCD(μm)2.61 ±0.14 1.90 ±0.14 53.76 ±11.00 1.68 ±0.38 Hyperthyroid 196.00 ±7.38 277.50 ±15.32＊＊ 1.36 ±0.11* 4.90 ±0.31* 3.49 ±0.21＊＊ 115.37 ±48.00＊＊ 3.27 ±0.66*

Figure 3.The relative expression level of CaMKⅡ mRNA in the two groups..n=10.*P＜0.05 vs control.圖3 2組CaMKⅡmRNA相對表達水平

4 心肌組織中CaMKⅡ蛋白表達與活性的變化

從圖4A可看出甲狀腺素刺激組與對照組心肌均有CaMKⅡ的表達，實驗組的CaMKⅡδ總蛋白的條帶較對照組淡和窄，而其磷酸化蛋白的條帶較對照組則明顯增寬變深;圖4B為CaMKⅡδ(A－17)總蛋白和CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白表達半定量分析。CaMKⅡδ(A－17)總蛋白:0.35±0.01與0.28±0.05，甲狀腺素刺激組CaMKⅡδ總蛋白表達水平僅為對照組的79%;CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白:0.26±0.02與0.40±0.03，差異為1.58倍，兩者差異顯著(P＜0.05)。

Figure 4.The protein expression of CaMK Ⅱδ(A －17)and CaMK Ⅱ(Thr286).1～4:hyperthyroid;5～6:control..n=10.*P＜0.05 vs control.圖4 CaMKⅡδ(A－17)和CaMKⅡ(Thr286)的表達

討 論

本研究發現:長期甲狀腺素刺激致心肌肥厚可降低心肌CaMKⅡ的表達，但其CaMKⅡ的活性卻增加，說明CaMKⅡ在甲亢性心臟病的發展中的發生了重要改變。甲狀腺素是維持機體新陳代謝、生長發育中具有重要作用的內分泌激素，心肌肥厚是甲狀腺功能亢進所致心肌損害的嚴重并發癥，其血流動力學表現為心率加快、心輸出量增加、心肌收縮力增強及舒張期縮短［3］。在慢性甲狀腺素刺激誘導甲亢性心臟病時，甲狀腺素通過何種途徑參與心肌損害的發生發展，其具體發生機制仍不太明確。目前研究認為以下途徑可能參與甲亢性心臟病的發生發展:(1)甲狀腺素通過甲狀腺素受體(thyroid hormone receptors，TRs)結合到細胞染色體上，調控靶基因的調節區域，從而影響其相應靶基因的表達(即經典基因調控機制)，如甲狀腺素誘導β－肌球蛋白重鏈(β－myosin heavy chain，β－MHC)向 α－肌球蛋白重鏈(α－myosin heavy chain，α－MHC)亞型的轉換、增加 SR膜上 RyR2和SERCA2a的表達、降低PLB的表達及上調β－腎上腺素受體(β －adrenergic receptor，β － AR)等［1］;(2)細胞信號轉導通路(即非基因調控機制)，如甲狀腺素可激活 MAPK、mTOR/AKT、ERK等信號轉導通路，促使心肌細胞及心肌纖維增殖肥大，并且抗細胞增殖藥物雷帕霉素可抑制甲狀腺素所致心肌肥厚［4－6］;同時也有研究表明:長期甲狀腺素刺激的大鼠可增加其血液和組織中的腎素和血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)水平以及激活機體交感腎上腺系統，但甲狀腺素使心肌組織中腎素和AngⅡ水平升高不依賴β－AR激活以及血液中腎素－血管緊張素－醛固酮系統(renin－angiotensinaldosterone system，RAAS)的激活，交感神經拮抗劑或雙腎切除術都無法阻止甲狀腺素所致心肌肥厚［7］，提示有其它信號機制參與甲亢性心臟病發生發展。

CaMKⅡ是Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶的成員之一，目前研究發現CaMKⅡ在心臟中有細胞核型CaMKⅡδB和胞漿型CaMKⅡδC兩種不同的剪接體，前者主要參與基因的表達調控，而后者主要參與Ca2+依賴的信號轉導途徑［8］。過度表達CaMKⅡδC小鼠會引起心腔明顯擴大、心肌功能障礙、細胞內Ca2+穩態失衡及猝死［8］;而過度表達CaMKⅡδB的心肌細胞有明顯的肥大，而抑制CaMKⅡ活性及表達可減輕心肌肥大、改善心功能及降低惡性心律失常甚至猝死的發生［8－9］;大量研究表明慢性轉基因抑制 CaMKⅡ或CaMKⅡ抑制劑KN－93均可減輕心肌對慢性β－AR刺激的反應［10］。提示心肌細胞內CaMKⅡ在心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的發生發展中起著重要的信號轉導作用［11］。CaMKⅡ的激活包括鈣調蛋白(calmodulin，CaM)依賴性激活和非CaM依賴性的氧化激活。前者與β－AR和α－AR信號系統激活密切相關，機體交感腎上腺系統激活導致胞漿內Ca2+濃度(［Ca2+］i)增加，當［Ca2+］i水平升高時，Ca2+與 CaM 結合，后者結合到CaMKⅡ的調節域，改變激酶的構象，激活CaMKⅡ;而當［Ca2+］i降低時，CaMKⅡ自身抑制區和催化域相結合，阻止底物和Mg2+/ATP結合到酶的催化中心，使其激酶處于自身抑制的無活性狀態［10，12］。非CaM依賴性的氧化激活途徑與CaMKⅡ調節域內甲硫氨酸殘基Met281/282的氧化有關，Met281/282的氧化可以阻止催化域與調節域的抑制性結合，引起激酶構象改變，從而激活CaMKⅡ［13］。研究發現，用H2O2處理的Jurkat細胞在沒有Ca2+的情況下可通過活性氧介導機制激活CaMKⅡ［14］。

甲狀腺素如何影響心肌細胞內CaMKⅡ的表達和活性，其具體發生機制尚無定論，但相關研究提示兩者之間相互影響。Jiang等［15］研究表明短期(7 d)甲狀腺素降低兔心肌CaMKⅡ的表達和活性，值得提出的是:該模型并沒有提到造成了兔心肌肥大;另外，大劑量短期(14 d)甲狀腺素(1 mg·kg－1·d－1)皮下注射也未導致狗心肌肥大［16］;因而對甲亢性心臟病時CaMKⅡ表達和活性的改變尚不清楚的。甲狀腺素增加心肌SR膜上SERCA2a和RyR2通道的表達和活性，同時降低心肌SR膜上PLB的表達及活性，減少PLB對SERCA2a的抑制效應，上述效應將明顯提高SR內Ca2+轉運速度，導致單位時間內Ca2+在胞漿內滯留間期縮短，引起CaMKⅡ的CaM依賴性激活能力下降［1］，從生理意義上講，心肌內CaMKⅡ表達下降是機體平衡甲狀腺素使SR內Ca2+轉運能力增強的一種生理性適應;同時也有研究表明:甲狀腺素誘導兔骨骼肌的β－MHC向α－MHC的轉換過程中，其肌纖維中CaMKⅡ全酶的構成亞基及含量存在著差異并可能與CaMKⅡ表達及活性下降有關［17－18］。我們的研究發現:在慢性甲狀腺素刺激誘導心肌肥厚模型中，甲狀腺素降低心肌CaMKⅡ的表達，但其CaMKⅡ的活性卻增加，但其具體機制仍需要進一步研究證實。其原因可能與下面因素有關:(1)長期甲狀腺素刺激可增加大鼠血液和心肌組織中的腎素和AngⅡ水平［7］，導致其心肌 CaMKⅡ的活性升高;(2)長期甲狀腺素刺激引起機體交感腎上腺系統過度亢進，蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)過磷酸化可使活性狀態下的RyR與FK506結合蛋白12.6(FK506 bindingproteins 12.6，FKBP12.6)解離，同時上調心肌SR膜上PLB的表達，增加PLB對SERCA2a的抑制效應［19］，降低SR內Ca2+轉運速度，當上述效應強于甲狀腺素使SR內Ca2+轉運能力增強時，將導致心肌舒張期胞漿內［Ca2+］i升高，從而引起CaMKⅡ激活;(3)長期甲狀腺素刺激引起心肌無氧代謝增強，心肌存在過度氧化應激可能使CaMKⅡ的非CaM依賴性的氧化激活途徑增強。由于活性增加的CaMKⅡ可導致心肌肥大［9］，我們的研究提示:在慢性甲狀腺素刺激誘導甲亢性心臟病時，可以考慮應用CaMKⅡ抑制劑來抑制心肌肥厚和心肌纖維化。

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