石菖蒲不同藥效部位改善阿爾茨海默病模型小鼠的認知功能*

田素民，馬宇昕，孫靈芝，譚 亮，劉 靖，李國營△

(廣東藥學院基礎學院1生理學教研室，2人體解剖學教研室，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見的神經系統退行性疾病，其典型的病理學特征包括淀粉樣β蛋白(amyloid β －protein，Aβ)沉積形成老年斑，神經元細胞內神經纖維纏結，病因和發病機制目前仍不明確。Aβ的異常沉積被公認為導致AD的最后共同途徑［1］，Aβ持續損傷神經細胞將導致認知障礙和行為障礙［2］。近年來，一氧化氮(nitricoxide，NO)作為氣體信號分子參與學習記憶的生理和病理過程，引起了研究者們的高度重視。研究表明NO可誘發長時程增強作用(lone－term potentiation，LTP)這一突觸可塑性及學習記憶的主要機制。一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)是體內催化生成NO的關鍵性酶，它的變化即意味著NO的改變。石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，具有開竅豁痰、化濕開胃、醒神益智之功效，有研究表明石菖蒲還具有抗癡呆、改善學習記憶的功效，是臨床所有抗癡呆、改善記憶的中藥復方中最常用的單味中藥［3－5］。為研究石菖蒲的抗癡呆、改善學習記憶功效的有效部位，及改善Aβ致小鼠認知功能損傷的機制，擬采用海馬內注射Aβ1－42建立認知障礙小鼠模型，觀察石菖蒲不同藥效部位對認知功能障礙小鼠大腦勻漿和海馬組織中NOS活性的影響，探討石菖蒲不同提取部位改善Aβ致小鼠認知功能障礙是否與NOS機制相關，為揭示臨床應用石菖蒲治療抗老年性癡呆、改善記憶功能的機制提供理論依據。

材料和方法

1 材料

Aβ1－42(Anaspec)，石菖蒲 (粵Y20060076，批號20100801，產地山西，廣州市天河寶潤堂中藥飲片廠)，改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)，NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，萬能粉碎機(FZ－220型，溫嶺市牧嶼百樂機床廠)，循環水式真空泵(SHZ－DCⅢ，河南省鞏義市英嶼予華儀器廠)，小鼠腦立體定位儀(ST－3ND，成都儀器廠)，Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司)，石蠟切片機(金華市益迪醫療設備)。

2 方法

2.1 AD動物模型制備及動物分組 健康成年雄性NIH小鼠(9周齡)、體重18～20 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008－0002。AD動物模型按如下方法制備:Aβ1－42干粉(500 μg)溶解在含有1%NH4OH 250 μL 的生理鹽水中，混勻，即Aβ1－42溶液濃度稀釋至2 g/L，37℃恒溫箱孵育1周左右，使其轉變為聚集態。小鼠稱重后，用戊巴比妥鈉進行麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)。用腦立體定位儀取平顱頭位固定小鼠，剪開頭皮，暴露前囟，按小鼠腦立體定位圖譜進行定位［6－7］，在前囟后 2 mm，正中線旁 1.5 mm，顱骨表面下1.9 mm為雙側海馬CA1注射點。用微量注射器緩慢注入 Aβ1－42，每側2 μL，進樣速度為 0.8 μL/min。注射完畢，留針5 min后，緩慢退針以防拔針時藥物溢出。術后骨蠟封口，縫合傷口［8］，連續3 d肌注青霉素G 8×105U以防感染。

AD模型組動物首先從制備過程順利、出血少、術后恢復良好的小鼠中選取。然后，通過水迷宮測試，以生理鹽水模擬注射小鼠和正常小鼠為對照，將認知功能有顯著差異的Aβ1－42注射小鼠留作實驗(該模型成功率85.71%)。隨機分為4組:生理鹽水灌胃組、水煎液灌胃組、去油水煎液灌胃組和揮發油灌胃組，每組6只。

2.2 石菖蒲不同藥效部位的提取［9］藥材經鑒定為正品天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，藥材打粗粉，過2號篩(20目)。

2.2.1 揮發油部位 稱取石菖蒲粗粉200 g，加10倍量水，浸泡1 h，加沸石幾粒，水蒸氣蒸餾法提取，至揮發油不再增多時，停止加熱。測得揮發油含量1.56% ＞1.0%，符合藥典標準。灌胃前取揮發油適量，用1% 吐溫－80稀釋100倍備用。

2.2.2 去油水煎液部位 收集提取揮發油后的石菖蒲殘渣，經真空泵過濾，濾液濃縮至200 mL(1∶1)。

2.2.3 水煎液部位 石菖蒲粗粉200 g，加10倍量的水，浸泡1 h，回流提取1 h，殘渣用1000 mL水進行煎煮。合并2次濾液，低溫濃縮至200 mL，即為石菖蒲水煎液(1∶1)。

2.3 AD模型小鼠灌胃給藥 生理鹽水灌胃組(作為石菖蒲灌胃的對照組，0.25 mL/10 g BW)、水煎液灌胃組(0.2 mL/10 g BW)、去油水煎液灌胃組(0.2 mL/10 g BW)和揮發油灌胃組(0.2mL/10 g BW)，連續灌胃3周。

2.4 水迷宮測驗 Morris水迷宮包括小鼠行為學測試系統、圖像自動監視處理系統及數據處理分析系統。水池直徑120 cm，高60 cm，平臺直徑12 cm，水溫(25±2)℃。(1)定位航行實驗:所有小鼠進行隱藏平臺實驗，歷時5 d，每天定時訓練4次，將小鼠依次從4個指定的標記點，面向池壁放入水中［10］，記錄小鼠在1 min內尋找平臺所需時間 (逃避潛伏期)。在每個時間段的訓練中，如小鼠在1 min內成功爬上平臺，記錄下其所需的時間，并允許它們在平臺上呆30 s，然后結束該次訓練。如果小鼠在1 min內未能找到平臺，將其引導到平臺上，并停留30 s，逃避潛伏期記錄為1 min。逃避潛伏期越長，代表小鼠的學習記憶能力越差。(2)空間探索室驗:第6 d撤出平臺，任選1個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在1 min內進入原平臺象限的時間。

2.5 組織樣品處理及檢測 小鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)，斷頭處死，迅速于冰盒上取大腦或剝出完整的海馬，將組織置于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重，制成10%大腦勻漿和10%海馬勻漿。3000 r/min離心15 min，取上清液。采用考馬斯亮藍測定法測定組織中蛋白含量，分光光度法測定組織中NOS含量。具體操作均按照試劑盒說明書進行。

2.6 免疫組織化學方法檢測腦組織中NOS的表達 小鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg，50 g/L，ip)，施行左心室－主動脈灌注，先用0.9%生理鹽水快速沖洗血液，繼之，用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4，4℃)繼續灌注，待充分固定后，迅速取材腦組織，并置于上述相同固定液中4℃后固定過夜。NOS免疫組化染色具體步驟如下:切片常規脫蠟至水，浸入0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波修復20 min。冷卻后用3%過氧化氫室溫孵育30 min以滅活內源性酶。5%BSA室溫30 min。每張切片加1∶100 NOS抗體，4℃過夜。生物素化山羊抗兔IgG室溫孵育40 min。SABC室溫孵育30 min。DAB顯色，陽性顯色為棕黃色。各步驟間PBS(pH 7.4)洗滌3次。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片后光學顯微鏡進行觀察。

3 統計學處理

數據用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。數據以均數±標準差()表示。組間比較采用單因素方差分析ANOVA，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 水迷宮測驗

4組AD模型小鼠(生理鹽水灌胃組、水煎液灌胃組、去油水煎液灌胃組和揮發油灌胃組)空間探索實驗結果顯示，與生理鹽水灌胃組相比，灌服石菖蒲不同藥效部位(水煎液和揮發油)的2個組60 s內跨越平臺的次數和在目標象限的探索時間都明顯增加，差異顯著(P＜0.05)，去油水煎液灌胃組有改善但無顯著差異，見表1。

表1 4組小鼠空間探索比較Table 1.Comparison of spatial performance of mice in the four groups(.n=6)

表1 4組小鼠空間探索比較Table 1.Comparison of spatial performance of mice in the four groups(.n=6)

*P ＜0.05 vs AD plus saline group.

Group Frequencies of across platform in 60 s Swimming time in target quadrant(s)AD plus saline 2.250 ±0.510 16.705 ±0.771 AD plus decoctum 4.011 ±1.414* 26.145 ±0.770*AD plus decoctum without oil 3.018 ±1.414 20.085 ±0.516 AD plus essential oil 5.015 ±0.021* 22.110 ±0.665*

2 石菖蒲不同藥效部位對AD模型小鼠大腦組織NOS活性的影響

與生理鹽水灌胃模型組相比，灌服石菖蒲不同藥效部位的3組AD模型小鼠大腦組織NOS活性均有降低。其中，揮發油灌胃組與生理鹽水灌胃組相比小鼠大腦NOS活性有顯著差異(P＜0.05)，見表2。

3 石菖蒲不同藥效部位對AD模型小鼠海馬組織NOS活性的影響

灌服石菖蒲不同藥效部位的3組AD模型小鼠海馬組織NOS活性均明顯降低。與生理鹽水灌胃相比，石菖蒲不同藥效部位灌胃3組小鼠海馬NOS活性均有顯著差異(P＜0.01)，見表3。

表2 各組小鼠大腦NOS活性Table 2.NOS activity in the mouse cerebrum in each group(.n=6)

表2 各組小鼠大腦NOS活性Table 2.NOS activity in the mouse cerebrum in each group(.n=6)

*P ＜0.05 vs AD plus saline group.

AD plus saline 1.124 ±0.119 AD plus decoctum 1.106 ±0.455 AD plus decoctum without oil 0.933 ±0.066 AD plus essential oil 0.467 ±0.074*

表3 各組小鼠海馬NOS活性Table 3.NOS activity in the hippocampus of mice in each group(.n=6)

表3 各組小鼠海馬NOS活性Table 3.NOS activity in the hippocampus of mice in each group(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs AD plus saline group.

AD plus saline 1.180 ±0.036 AD plus decoctum 0.750 ±0.021＊＊AD plus decoctum without oil 0.755 ±0.163＊＊AD plus essential oil 0.624 ±0.040＊＊

4 免疫組織化學檢測

棕黃色的陽性產物分布于胞膜和胞漿，胞核不著色。陽性細胞多分布在海馬、齒狀回和皮質，正常組海馬NOS陽性神經元以錐體細胞為主，模型組則以圓形細胞為主。灌服石菖蒲不同藥效部位的3組和生理鹽水灌胃組相比，陽性神經元數量明顯減少，染色程度變淺，尤其是揮發油組(P＜0.05)，見圖1。免疫組織化學的定性和定量結果與上述NOS活性的檢測結果基本一致，見圖2。

討 論

學習和記憶屬于腦的高級功能，是認知活動的重要方面。評價動物認知功能的常用方法之一是學習記憶行為測試。Morris水迷宮可以檢測與海馬功能直接相關的空間學習記憶的形成和維持時間，被廣泛應用于神經生物學研究領域。Morris水迷宮的空間探索實驗用于檢測動物保持記憶的能力。本研究Morris水迷宮實驗結果顯示，AD+石菖蒲不同藥效部位灌胃組的小鼠和其對照組相比，前者在目標象限的探索時間和60 s內跨越平臺的次數均有增加。其中水提液灌胃組和揮發油灌胃組對小鼠認知功能的改善最為明顯，與對照組相比差異顯著。這表明石菖蒲揮發油組和水煎液組對學習記憶的改善作用更佳，這就意味著在這2組提取液中含有對改善學習記憶功能更有效的藥效成分，這為進一步研發抗老年性癡呆的藥物提供了科學依據。

Figure 1.After mice were treated with different fractions of Acori graminei rhizome，NOS expression in the brain was shown.A1，A2:AD plus saline group;B1，B2:AD plus decoctum group;C1，C2:AD plus decoctum without oil group;D1，D2:AD plus essential oil group.Scale bar=100 μm.圖1 各組小鼠灌服石菖蒲不同藥效部位后，NOS在腦組織中的表達

Figure 2.Comparison of IA of NOS positive cells in mouse brain tissues..n=6，*P＜0.05 vs AD plus saline group.圖2 各組小鼠腦組織內NOS陽性細胞IA的比較

NO是一種中樞神經系統細胞間的氣體信號分子，與神經系統的發育、成熟、學習記憶等密切相關。海馬LTP被認為是突觸可塑性和學習記憶的主要機制［1，11］。NO從突觸后釋放，通過擴散作用于突觸前神經末梢及膠質細胞，提高自發的小規模興奮性突觸后電位，誘發LTP［1］。NO對中樞神經系統疾病生理病理的關鍵作用已經明確，既具有潛在的保護作用，又有神經毒性作用［12］。正常情況下，神經元合成和釋放適量的NO，參與導向軸突生長、促進遞質釋放、參與突觸可塑性。但若NOS持續增加，NO釋放過多，則會誘發細胞毒性作用，從而導致細胞受損，加速神經元凋亡或死亡［13］。也有研究表明過多NO的毒性作用會導致學習記憶障礙［14］。目前普遍認為NO對AD的神經毒性作用已遠遠超過了其保護作用［1］。從本實驗對石菖蒲不同部位灌服后，其生化檢測和免疫組織化學檢測的結果來看，石菖蒲不同藥效部位對大腦和海馬內NOS總的影響是降低NOS活性。但結果也表明石菖蒲不同藥效部位灌胃后，對記憶功能和NOS活性的影響是不同的。其中揮發油和水提液灌胃組對AD模型小鼠認知功能的改善、NOS活性的降低效果最為顯著。這和以往研究結果有所不同，以往認為，石菖蒲改善認知功能的藥效部位主要在揮發油成分，而本研究的結果提示，在石菖蒲的水溶性成分中，含有同樣重要的藥效成分，或重要的藥效協同成分，這和前述的Morris水迷宮實驗結果是一致的。就石菖蒲改善學習記憶能力的NOS機制來看，可能是由于水提液灌胃組、揮發油活性和去油水煎液灌胃后抑制了NOS的合成，使大腦和海馬內源性NO合成釋放隨之較少，可使神經元誘發和維持LTP，增強突觸傳遞效應，通過這種機制改善學習記憶能力。也可能與石菖蒲能調節某些神經遞質的釋放去影響NO的合成釋放，從而促進學習記憶能力的恢復有關。石菖蒲不同藥效部位在體內的作用很可能存在復雜過程和機制。本研究僅從NOS角度做了初步探討，更深入和確切的機制還需進一步研究。

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