正常與退變椎間盤纖維環細胞相關基因的差異表達*

葉冬平，梁偉國，戴麗冰，沈 雁，陳鴻輝

(暨南大學醫學院第四附屬醫院，廣州市紅十字會醫院，廣州市創傷外科研究所，廣東 廣州 510220)

椎間盤退變始于髓核，多數學者認為是多因素協同作用的結果。由于椎間盤在解剖學和生理學上具有孤立性和被包裹特征，為椎間盤退變的生物治療(細胞因子、細胞移植、基因轉染、基因治療)提供有利的條件。椎間盤纖維環退變制機與髓核退變相似。由于髓核退變，椎間盤應力傳遞不均勻，致使纖維環應力過多聚集某一部位，加劇了纖維環的退變。本研究根據前期學者相關研究結果，采用實時熒光定量PCR(real－time qRT－PCR，SYBR Green)技術，檢測17個與椎間盤退變相關的基因［包括合成代謝因子:骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)、骨形態發生蛋白14(bone morphogenetic protein 14，BMP －14)、骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP －4)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板源性生長因子(platelet－ derived growth factor，PDGF)、骨形態發生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP －2)、轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、胰島素樣生長因子 1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、金屬蛋白酶1組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1)和 SOX9轉錄因子(sex determining region Y－box 9，SOX9);分解代謝因子:基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3，MMP3)、白細胞介素－1(interleukin－1，IL－1)和誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS);細胞外基質:I型膠原α1鏈(collagen type I，alpha 1 chain，COL1A1)、II型膠原 α1 鏈(collagen type II，alpha 1 chain，COL2A1)和聚蛋白多糖(aggrecan)］，研究其在人正常和退變椎間盤纖維環細胞中表達量的差異，以期探討這些相關基因與椎間盤退變的關系，篩選明顯差異基因作為退變纖維環細胞體外刺激因子，為生物治療椎間盤退變奠定基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞 人正常髓核細胞，細胞原代培養標本均源自本院因外傷致脊柱爆裂性骨折手術的患者，共3例，腰1～2椎間盤1例，腰3～4椎間盤2例，手術均為前側入路減壓，較完整地取出椎間盤，其中平均年齡32歲。根據Gries等［1］評分標準，均未見退變。

人退變髓核細胞，細胞原代培養標本均源自本院因腰椎退行性變手術的患者，共3例，其中腰3～4椎間盤1例，腰4～5椎間盤2例，平均年齡75歲。根據 Gries等［1］評分標準及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，均為重度退變。本研究均征得本人及家屬的知情同意，且通過了廣州市紅十字會醫院倫理委員會的批準。

1.2 試劑 高糖DMEM培養基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青－鏈霉素溶液(吉諾生物醫藥技術有限公司)，0.25%Trypsin和0.02%EDTA溶液(吉諾生物醫藥技術有限公司)，Trizol試劑(Gibco)，0.01 mol/L PBS液(Gibco)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，逆轉錄試劑盒(Promega)、25 cm2細胞培養瓶(Corning)。

1.3 儀器 CO2培養箱(Thermo 8000DH)，81－2型恒溫磁力振動攪拌機(上海司樂儀器廠)，倒置光學相差顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti－U)，自動平衡離心機(LDZ4 －0.8)，超凈工作臺(SW－CJ0－ICU)，ABI 3900臺式高通量DNA合成儀(ABI)，科大創新 HC－3018R高速冷凍離心機，ABI 9700 PCR儀(ABI)，ABI 7500全自動熒光定量PCR儀(ABI)

2 方法

2.1 細胞分離、培養及傳代 手術均從后側入路，能完整取出椎間盤。分離纖維環組織與髓核組織時，依靠肉眼、手感等進行區分。纖維環組織呈白色略硬韌性軟環狀，用眼科剪充滿阻力，韌性較高。分離清楚后，用含雙抗(青－鏈霉素)的生理鹽水浸泡椎間盤纖維環組織10 min，雙抗生理鹽水浸泡沖洗3～4次。用眼科剪將纖維環組織剪成大小為1 mm×1 mm×1 mm大小，放入盛有10 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的100 mL燒杯中，37℃磁力攪拌器攪拌約60 min。待組織完全溶解后，200目的濾網過濾，1000 r/min離心10 min，棄去上液，用含10%胎牛血清的DMEM培養基1～2 mL輕輕吹散細胞，吸至25 cm2培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基6～8 mL，靜置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養3 d。3 d后倒置顯微鏡觀察細胞貼壁生長情況，隔天換液。

當細胞接近90%匯合時進行傳代。棄掉培養液，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞2次，棄掉液體。沿瓶壁加入2 mL 0.25%Trypsin+0.02%EDTA溶液，輕晃動培養瓶，鏡下觀察消化情況。鏡下見細胞皺縮、間隙加大、大部份細胞變圓漂浮時立即用含血清的培養液3 mL終止消化;用吸管輕輕吹打細胞數次制成細胞懸液。接種:細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM培養液混懸細胞后按1∶2接種。培養條件同原代培養。

2.2 引物探針設計合成 GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區設計特異性引物，Primer Express 2.0軟件設計引物探針，中山大學達安基因股份公司合成，見表1。

2.3 細胞總RNA的提取 105個細胞置于1.5 mL Eppendorf管，加Trizol 1 mL。加入氯仿0.2 mL，蓋緊蓋子，用力搖動15 s，15～30℃孵育2～3 min，4℃ 12000 r/min離心15 min，取上清液至新的1.5 mL Eppendorf管。加與上清液等體積的異丙醇，15～30℃孵育樣品10 min，4℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清液，75%乙醇(含DEPC水)洗滌沉淀1次(至少1 mL 75%乙醇/mL Trizol)，4℃ 7500 r/min離心5 min，棄乙醇，空氣或真空干燥5～10 min(不要完全干燥)，加DEPC處理水溶解RNA，－80℃保存備用。若長期保存，加入2.5倍體積乙醇，置－80℃保存。

2.4 逆轉錄反應 取4 μL RNA模板做逆轉錄反應，儀器為ABI 9700儀(ABI)，反應體系如下:5×逆轉錄 buffer 4μL，下游引物 R(10 μmol/L)0.4 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，MMLV(2 ×108U/L)1 μL，DEPC 水 10.1 μL，RNA 模板 4 μL，總體積 20 μL。

2.4.1 逆轉錄 buffer成分 50 mmol/L Tris－HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT。

2.4.2 反應條件 37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。

2.5 熒光定量PCR反應

2.5.1 陽性標準品及其梯度的制備 標準曲線定量法。h

表1 引物序列和產物長度Table 1.The primers sequences and product pength

2.5.2 陽性標準品的制備 預實驗PCR擴增的陽性產物經過2%低熔點瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶，用TAE緩沖液配制)，在長波紫外下，割下目的條帶。用回收試劑盒(QIA-quick Gel Extraction Kit)回收純化。測定 A260/280＞ 1.8，表明純度合格。用A260測定值和片段長度數據換算出濃度(106copies/L)，即為陽性標準品。

2.5.3 陽性標準品梯度的制備 取陽性標準品5 μL按10倍稀釋(加水45 μL并充分混勻)，依次稀釋下去，制備成陽性定量標準品梯度，倍比稀釋一定要準確，否則影響定量結果。每次上機必須新鮮配制陽性定量標準品梯度，正式上機時以包含所有樣本的5個梯度上機即可。

2.5.4 陰性質控標準品 采用滅菌雙蒸水。

2.5.5 待測樣本和陽性標準品的反應體系 5×染料PCR buffer 10 μL，上游引物 F(10 μmol/L)1 μL，下游引物 R(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(3 ×106U/L)1 μL，cDNA 或陽性標準品 5 μL，ddH2O 31 μL，總體積 50 μL。

2.5.6 PCR buffer成分 10 mmol/L Tris－ HCl(pH8.0)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2。

2.5.7 反應條件 93℃ 3 min，然后93 ℃ 30 s，55℃ 45 s，共40循環。

3 統計學處理

結 果

1 人正常和退變纖維環細胞光學形態

人正常纖維環細胞與退變纖維環細胞表形沒有明顯差異，細胞呈短梭形和長梭形，有明顯的極性;正常纖維環細胞較退變纖維環細胞胞質飽滿，核仁稍大，以短梭形居多;退變纖維環細胞較正常纖維環細胞生長快，易培養，以長梭形居多，近似成纖維細胞，見圖1、2。

Figure 1.Human normal AF cells(×200).圖1 人正常纖維環細胞

Figure 2.Human degenerative AF cells(×200).圖2 人退變纖維環細胞

2 熒光定量PCR結果

與正常纖維環細胞相比，退變纖維環細胞TGF－β、IL－1、PDGF和IGF－1 mRNA表達量降低(P ＜0.01，P ＜0.05);bFGF、TIMP－1、COL1A1和 BMP－14 mRNA 表達量升高(P＜0.01);正常纖維環細胞 aggrecan和BMP－2 mRNA高表達，退變纖維環細胞兩者表達陰性;COL2A1、iNOS和MMP3在正常纖維環細胞mRNA有表達，在退變纖維環細胞表達陰性;EGF在正常纖維環細胞mRNA表達陰性，在退變纖維環細胞有表達。SOX9、BMP－4和BMP－7在正常和退變纖維環細胞mRNA表達均為陰性，見表2。

表2 正常纖維環細胞與退變纖維環細胞椎間盤退變相關基因mRNA的表達Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

表2 正常纖維環細胞與退變纖維環細胞椎間盤退變相關基因mRNA的表達Table 2.The mRNA expression of intervertebral disc degeneration－related genes in normal AF cells and degenerative AF cells(.n=3)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs normal AF cells.

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討 論

I型膠原、II型膠原、糖胺多糖基因分析用于衡量椎間盤退變過程中細胞外基質的特征性改變。糖胺多糖和II型膠原mRNA在未退變的髓核細胞中含量豐富，在退變的髓核細胞中下降明顯，I型膠原則相反。這3種基因表達量的改變提示髓核細胞表型從類軟骨細胞轉化為成纖維細胞。

人椎間盤疾病不僅與其主要基質——蛋白多糖和膠原對應的基因改變相關，而且與影響椎間盤基質的細胞因子基因有關［2－3］。編碼髓核細胞合成代謝因子的 BMP －2、4、7、14、TGF － β、IGF －1，EGF、PDGF、bFGF 和 SOX9 基因在退變髓核細胞中下降明顯。在其它肌肉骨骼組織中，這些基因被證實是創傷過程中促進組織愈合、逆轉退變過程的始動基因。炎癥調節因子如IL－1等可以提高滑膜和軟骨BMP－2、BMP－7 mRNA和蛋白的表達。這些基因在退變椎間盤髓核細胞中表達量明顯下降的機制尚未明確，但因為椎間盤無血管支配、細胞數目較少、免疫豁免等特征，生長因子基因的下調可能是椎間盤細胞特有的現象。這一特有現象可能是椎間盤細胞退變的一種機制。椎間盤細胞合成代謝因子基因的明顯下降，提示這些生長因子可以作為基因治療退變椎間盤的候選因子。

生長因子是目前研究最為深入和廣泛的治療椎間盤退變的蛋白質，它是通過增加細胞活性、提高細胞增殖效率、上調合成代謝通路等增加蛋白多糖含量。在眾多生長因子中，IGF、FGF、EGF、PDGF等被證實可以有效提高髓核細胞的增殖水平［4］。Gruber等［5］報道，IGF －1 和 FGF 能夠防止椎間盤細胞凋亡。BMPs家族、TGF－β、生長分化因子5不僅能夠促進細胞的增殖，而且可以促進細胞外基質糖胺多糖和Ⅱ型膠原的合成，保持了類軟骨細胞的表形特征。其它生長因子，如Nell－1(與BMPs家族類似，具有骨形成誘導作用)同樣具有潛在的逆轉椎間盤退變的作用［6］。

1991年Thompson等［4］首先報道體外培養的髓核細胞加入外源性生長因子可以促進細胞外基質蛋白多糖的合成。很多研究已經證實TGF－β1能夠促進髓核細胞外基質糖胺多糖和Ⅱ型膠原的表達。Chen等［7］指出TGF－β1可以持續刺激人髓核細胞增殖和蛋白多糖合成。Risbud等［8］最近報道TGF－β3可以使髓核細胞和纖維環細胞增殖、增加蛋白多糖聚集，效率遠比TGF－β1高。將外源性細胞內調節因子如:LMP－1、SOX9基因轉染入髓核細胞，可以明顯地增加髓核細胞外基質的糖胺多糖、Ⅱ型膠原的表達。Zhang等［9］以重組腺病毒為載體比較 BMP 家族各成員(2、3、4、5、7、8、10、11、12、13、14、15)、SOX9 基因等對牛髓核細胞外基質合成的影響，發現6 d后BMP－2和BMP－7基因治療組，蛋白多糖的生成明顯高于其它基因治療組。BMP－4和BMP－14基因治療組明顯地增加了膠原的合成。BMP－2基因治療組對髓核細胞的增殖效果明顯高于其它組。Zhang等［10］同時也得出轉染BMP家族的軟骨細胞與髓核細胞共培養，可以使髓核細胞分泌更多的蛋白多糖。

TIMP－1是一種細胞內基質金屬蛋白酶抑制因子。它能特異性與MMPs形成非共價鍵結合，阻止MMPs降解細胞外基質。細胞外基質各種分解酶與其抑制物的失衡可能是椎間盤退變的關鍵因素。TIMP－1分子與IGF－1、TGF－β、IL－1β等的關系已經有部分學者進行相關研究［11］。Gunther等［12］顯示TGF－β可以提高TIMP－1在人關節軟骨細胞的表達。因此，有學者認為TIMP－1受到生物力學應力的影響大于細胞因子的影響。Pufe等［13］在成人椎間盤細胞中增加應力，明顯抑制了TIMP－1的生成量。因為TIMP－1含量在椎間盤退變過程中明顯降低，它有可能是維持椎間盤代謝正平衡的重要調節因子，對基因轉染治療椎間盤退變帶來一個新的思路。本實驗示退變纖維環TGF－β、IL－1 mRNA低表達，而TIMP－1 mRNA高表達，其原因有待研究。

SOX9是Ⅱ型膠原合成過程中重要的轉錄因子，其在軟骨發育成熟過程中對Ⅱ型膠原基因COL2A1表達的增強和促使Ⅱ型膠原合成增加有明確的作用，SOX9基因作為一種翻譯因子基因，受到國內外眾多學者的關注和研究。退變的人椎間盤細胞中轉染腺病毒介導的SOX9基因，證實其可以使椎間盤細胞增殖、II型膠原及蛋白聚糖的合成得到增加［14］。進一步研究發現，大多數生長刺激因子都是通過提高SOX9 mRNA的表達，從而引起COL2A1表達的增加，相應地增加II型膠原及蛋白聚糖的合成［15］。但在本實驗SOX9在正常和退變纖維環細胞mRNA表達陰性，原因有待進一步研究。

張小衛等［16］通過基因芯片分析人正常和退變頸椎間盤組織基因表達譜的差異，發現多種基因表達異常與頸椎間盤退變相關，有570個基因發生差異表達，其中上調550個，下調20個。我們選擇了17個與椎間盤退變相關基因，采用實時熒光定量PCR技術進一步驗證。本研究表明:椎間盤纖維環退變與 TGF－β、IL－1、PDGF、IGF－1、aggrecan和 BMP－2 mRNA 低表達，bFGF、TIMP －1、BMP －14、COL1A1 mRNA 高表達相關;退變纖維環COL1A1 mRNA高表達與西安大學醫學院對退變頸椎間盤研究結果一致，提示退變纖維環細胞COL1A1蛋白表達可能增高。根據本研究結果BMP－2、TGF－β、PDGF和IGF－1可作為退變纖維環細胞體外刺激因子備選，逆轉椎間盤退變研究;bFGF、TIMP－1和BMP－14 mRNA高表達，可能是椎間盤纖維環細胞退變的標志物。BMP－2 mRNA在正常纖維環細胞高表達，而退變纖維環細胞mRNA表達陰性;bFGF mRNA在退變纖維環細胞表達明顯高于正常纖維環細胞，因此本課題下一步擬用BMP－2和bFGF刺激退變椎間盤纖維環細胞，研究比較這兩種極端表達因子對纖維環細胞生物學特性的影響。

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