MicroRNAs與可卡因成癮關系的研究進展*

王芬芬，沈 杰，張吉翔，3△

(南昌大學1第二附屬醫院消化內科，2第二附屬醫院教學管理辦公室，3江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006)

可卡因進入體內會導致海馬、前額葉皮層、中腦腹側被蓋區及伏隔核等學習記憶相關腦區的多巴胺、谷氨酸、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等神經遞質釋放的異常變化，通過作用于相應的受體引發一系列分子事件:包括激活細胞內信號轉導通路，改變神經營養因子、轉錄因子、即刻早期基因或染色體的結構等，并最終引起突觸的可塑性，甚至神經元的形態結構發生變化，從而導致成癮形成。

近年來研究發現，過度攝取可卡因后將誘導一類微小RNAs(microRNAs，miRNAs)轉錄或翻譯水平的改變，這一分子事件對可卡因成癮的形成具有重要調節作用，包括促進和抑制作用。深入研究miRNAs與可卡因成癮形成之間的內在聯系及具體調節機制，將為治療可卡因成癮提供一條全新的途徑。本文就miRNAs的結構、分布、功能及不同miRNAs在可卡因成癮形成過程中的具體調控機制等作一綜述。

1 miRNAs的結構、分布及功能

miRNAs是一種長度為18～24核苷酸單鏈的內源性非編碼小RNA，在進化過程中高度保守，通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(3'-untranslated region，3'UTR)的結合位點(miRNA binding site)結合，在轉錄后水平調節基因表達，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發育等多種生物學過程［1］。miRNAs可以從多個層面發揮調控基因表達的作用:(1)與靶基因3'UTR結合，抑制靶基因的翻譯;(2)與靶基因3'UTR結合，引起靶基因mRNA的降解;(3)誘導基因組特定區域組蛋白的甲基化，從而調控基因轉錄活性。人大約有1000多個miRNAs［2］，研究分析表明，人類絕大多數基因受miRNAs的調控［3-4］。哺乳動物神經系統中存在大量的miRNAs，其中約有70% 可在腦組織中表達;神經系統中miRNAs呈現出高時序性、高保守性和高特異性的表達方式，參與調控神經系統的生長發育、神經元分化、突觸可塑性及高級神經功能(如生物鐘、記憶、學習)等［5］。最新研究發現，miRNAs可以改變某些可卡因成癮相關基因的表達、減弱或增強可卡因產生的獎賞效應，從而調控可卡因成癮的形成。目前已經發現的與可卡因成癮相關的miRNAs有:miR-212、miR-132、miR-124、let-7d、miR-181a及 Ago2 依賴型 miRNAs(Ago2-dependent，induced by cocaine and Drd2-enriched miRNAs，ADICD miRNAs)等，它們通過多種途徑參與可卡因成癮的調控過程。

2 miRNA與可卡因成癮

2.1 miR-212、miR-132與可卡因成癮 miR-212位于人類第17號染色體短臂17p13.3-D片段上，主要分布于紋狀體、伏隔核區、海馬區、中腦腹側被蓋區以及小腦等處［6］。已經發現的100多個miR-212靶基因中，與可卡因成癮相關的有Sprouty相關細胞膜蛋白(Sprouty-related with EVH1 domain-containing protein 1，SPRED1)基因［7］。miR-132 是與 miR-212受同一順式調控元件控制，從同一個多順反子轉錄前體加工成熟的miRNA;它們在基因組上呈串聯排列，成簇分布［8］。

Hollander等［7］發現急性可卡因給藥會誘導大鼠紋狀體中miR-212和miR-132表達上調，表明miR-212和miR-132與可卡因成癮有一定關系。隨后他們進行了更深入的研究，結果顯示:與短時用藥(1 h 0.5 mg/kg每天自身給藥)訓練和正常對照組相比，長時用藥(6 h 0.5 mg/kg每天自身給藥)反復訓練會導致大鼠截然不同的行為表現以及某些基因表達水平的差異。如長時可卡因用藥訓練大鼠行為上表現出可卡因攝入量隨訓練次數增加而增加，而短時用藥訓練大鼠可卡因攝入量始終保持恒定水平，前者的總攝入量也明顯高于后者;同時，長時用藥訓練大鼠覓藥動機比短時用藥組和對照組大鼠更高;此外，長時給藥訓練組大鼠紋狀體中miR-212和miR-132的表達明顯升高，表達量約為1.4倍短時訓練組以及1.75倍對照組。用反義寡核苷酸特異性減少大鼠紋狀體中miR-212的表達不影響miR-132的表達，發現長時給藥訓練組大鼠可卡因攝入量明顯增加，而短時給藥訓練組和對照組大鼠可卡因攝入量無明顯差異;此時，長時給藥訓練組大鼠對可卡因的渴求明顯高于短時給藥組和對照組。以上結果提示我們，只有當機體攝入一定劑量可卡因后，所產生的獎賞效應才足以刺激紋狀體中的miR-212和miR-132過度表達。隨后的研究發現，miR-212是通過放大cAMP反應序列結合蛋白 (cAMP-responsive element binding protein，CREB)信號途徑而發揮其抗可卡因成癮的功能。

1987年，Montminy等發現有一種分子量約為43 kD的蛋白質可與生長抑素基因的cAMP反應元件(cAMP response element，CRE)有高度親和力，于是命名為CREB。CREB是cAMP通路下游的一種核轉錄因子，具有DNA結合結構域和轉錄激活結構域，分別與它們的DNA結合活性和轉錄調節活性有關。其轉錄激活結構域中133位的絲氨酸殘基可被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Ca2+/CAM 依賴性激酶、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等磷酸化，磷酸化的CREB可參與cAMP誘導的多種靶基因的轉錄調控;在神經系統中，CREB可能介導神經遞質誘導的基因表達，并能通過放大神經營養因子的信號，參與神經細胞增殖分化、存活等生物效應［9］。CREB還是一種調控可卡因獎賞作用的負性調控因子，其功能和表達的降低與可卡因獎賞效應及戒斷后的抑郁癥狀密切相關［10］。大量研究證實，控制情緒反應的中腦邊緣多巴胺系統是與藥物成癮密切相關的獎賞系統中樞所在，而中腦腹側背蓋區(ventral tegmental area，VTA)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)更是關鍵區域。VTA的主要傳出纖維在NAc與中等大小棘突狀神經元形成突觸聯系，分2路投射至中腦黑質網狀區和蒼白球(舊紋狀體)。腦源性神經營養因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)與其受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrKB)結合后［11］，激活 NAc 的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，進而促進CREB磷酸化。磷酸化的CREB一方面促進NAc內強啡肽的分泌:強啡肽與VTA上κ-阿片受體結合后，負性調節VTA中多巴胺的運輸，使突觸間隙多巴胺減少，從而減弱可卡因產生的獎賞效應［12］;另一方面，磷酸化的CREB誘導紋狀體中miR-212和miR-132過表達，過表達的miR-212反過來進一步放大CREB信號途徑，從而協同CREB發揮抗可卡因成癮作用［7］。

miR-212放大CREB信號途徑的主要機制有:(1)miR-212提高胞內cAMP的水平，cAMP通過2條途徑放大CREB信號:包括a)G蛋白(guanylate binding protein，鳥苷酸結合蛋白)→腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)→cAMP→PKA 途徑，即 cAMP-蛋白激酶途徑［13-14］，PKA被 cAMP激活后，催化 CREB 133位絲氨酸殘基磷酸化，從而激活CREB;b)CREB活性調控因子或CREB輔助因子(transducer of regulated CREB activity，TORC)途徑:雖然CREB能和靶基因結合并激活表達，但有時激活效應活性較低;TORC是調節CREB活性的轉導蛋白，它能與CREB相互作用協調發揮激活效應［15-16］。cAMP通過誘導TORC乙酰化減少TORC降解［17］，從而提高胞內TORC，尤其是TORC2的水平，最終放大CREB/TORC級聯效應。(2)miR-212激活Raf蛋白:Raf蛋白家族包括:Raf、B-Raf和 Raf-1［18］。一方面，活化的 Ras/raf蛋白激活細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)［19］，激活后的 ERK 通過磷酸化激活一系列細胞膜表面以及細胞質、細胞核內的類似核糖體S6蛋白激酶(ribosomalprotein S6 kinase，RSK)的蛋白激酶底物，并與之共同入核的方式促進CREB磷酸化;這就是Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯通路，又稱ERK通路，是一條可被廣泛激活的MAPK通路［18-20］。另一方面，活化的Raf-1蛋白通過激活各亞型的AC，提高胞內cAMP水平［21］，再經cAMP-蛋白激酶途徑激活CREB。miR-212靶基因SPRED1是抑制Raf-1信號途徑的關鍵基因［22］，對ERK通路有一定的阻遏作用。miR-212下調SPRED1的轉錄和翻譯水平，從而解除其對ERK通路的抑制，見圖1。

Figure 1.miR-212 pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.miR-212 is up-regulated in the dorsal striatum of rats with a history of extended access to cocaine.Striatal miR-212 decreases responsiveness to the motivational properties of cocaine by markedly amplifying the stimulatory effects of the drug on cAMP response element-binding protein(CREB)signalling.This action occurs through miR-212-enhanced Raf-1 activity，resulting in adenylyl cyclase sensitization and increased expression of cAMP and the essential CREB co-activator TORC.圖1 miR－212調控可卡因成癮途徑

2.2 miR-124與可卡因成癮 miR-124是腦組織中表達最為豐富的一類miRNA，約占腦組織miRNA總量的25%～48%。miR-124在分化神經元和成熟神經元中大量表達。將miR-124轉染到HeLa細胞中發現，HeLa細胞的基因組表達模式向神經方向轉化，miR-124能使神經細胞的特性得以獲得并維持［23］。研究還發現，miR-124可以與超過1100個基因的基序相結合，并能抑制100多個基因的表達［23］，CREB和神經元限制性沉默因子(RE1 silencing transcription factor，REST)就是其靶基因之一;miR-124與CREB、REST的3'UTR結合位點結合后，將抑制它們的翻譯過程從而減少兩者的表達。反復給予可卡因后，機體產生一種負反饋調節以對抗可卡因成癮，即神經突觸釋放大量神經遞質如5-HT，5-HT經ERK通路抑制miR-124的表達，進而促進CREB、REST以及BDNF等的表達［24］，并最終調控可卡因成癮的形成過程。

2.3 與可卡因成癮相關的其它miRNAs Chandrasekar等［24］運用逆轉錄定量 PCR(qRT-PCR)技術，發現長時反復給予可卡因可誘導中腦邊緣多巴胺能神經元miR-124和let-7d表達下調，而miR-181a表達上調，提示let-7d、miR-181a與miR-124一樣，參與可卡因成癮過程的調控。它們主要通過影響轉錄調控因子［如CREB、轉錄阻遏子(transcriptional repressor)nucleus accumbens-1(NAC-1)、period2(Per2)蛋白、REST、BDNF、神經遞質受體(多巴胺受體、阿片類受體)以及信號蛋白MAPK4和磷脂酰肌醇4激酶2β(phosphatidylinositol 4-kinase type 2 beta，PI4K2β)］的表達水平，多途徑調控可卡因誘導產生的神經可塑性改變，見圖2。Eipper-Mains等［25］發現腹側紋狀體中高表達的miRNAs，如miR-8家族，通過一些微調途徑如影響神經遞質的代謝和多肽類激素的分泌，可促進藥物如可卡因誘導的神經可塑性改變。已知中腦邊緣多巴胺通路，尤其是腹側紋狀體的神經可塑性改變是參與成癮藥物獎賞作用的重要神經機制之一［26］;由此說明，miR-8家族也是調節可卡因成癮過程的miRNAs之一。

2.4 ADICD miRNAs 近年來，研究人員仍在不斷探索更多與可卡因成癮相關的miRNAs及其調控機制，為治療可卡因成癮提供新靶點。不久前，Schaefer等［27］發現給予野生型大鼠大劑量可卡因后，可誘導多巴胺受體2(dopamine receptor D2，Drd2)神經元內的63種miRNAs高表達，其中23種是argonaute 2(Ago2)依賴型miRNAs，又稱ADICD miRNAs;Ago基因編碼Ago 1、2、3和4蛋白，只有Ago2蛋白能夠抑制其靶基因ADICD miRNAs的表達［28］。高表達的 ADICD miRNAs在可卡因成癮形成過程中起促進作用，可能與其抑制抗可卡因成癮相關靶基因的表達有關。如:miR-18/23(CREB)、miR-3/23(Fos)、miR-6/2(FosB 3)、miR-3/23［細胞增強因子-2(myocyte enhancer factor 2，Mef2)］、miR-1/23(BDNF)以及 miR-369-3p(Mef2、FosB)［27］。但 ADICD miRNAs調控可卡因成癮形成的具體途徑和分子機制尚不清楚，有待進一步研究。

3 結語

Figure 2.miR-124，let-7d and miR-181a pathway in cocaine-induced synaptic plasticity.Several microRNAs affect the expression of many cocaine-regulated gene.The brain-enriched miR-124 is suppressed by chronic cocaine in the mesolimbic dopaminergic pathway(presumably by the induction of REST)，which induces expression of miR-124 target genes(BDNF，NAC-1，etc.)favoring the formation of addictive phenotype.Downregulation of let-7d results in induction of its target genes(DA-D3R).In contrast，miR-181a(also a brain-enriched miRNA)is markedly induced by cocaine，causing downregulation of its targets(PI4K2B，Per2 and RGS4).Study strongly supports the hypothesis that miR-124，let-7d and miR-181a are involved in a dynamic double-negative feedback loop，thereby regulating the differential expression of various genes in response to cocaine，which may result in the molecular adaptation leading to addiction.圖2 miR－124、let－7d和miR－181a調控可卡因成癮途徑

目前miRNAs調節可卡因成癮的作用還遠未被研究清楚，我們的認識可能只是冰山一角。到底有多少miRNAs參與了可卡因成癮的調控，其中又有哪些起促進作用，哪些起抑制作用，具體調控機制如何，這些問題還有待進一步深入研究。鑒定新miRNAs及其靶標在可卡因成癮患者體內的表觀遺傳學改變，以及其生物功能和藥理學的利用價值等可能成為今后一段時間miRNAs治療藥物成癮研究的重要內容。有人提出是否可以使用人工合成的miRNA寡核苷酸鏈(synthetic miRNA oligonucleotides)直接改變體內的miRNA表達水平，從而作為新型治療工具在包括可卡因在內的多種藥物成癮的治療中得到廣泛應用。總之，對miRNAs更深入的研究可望有助于解決包括可卡因在內的藥物成癮治療的難題。

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