人類腎上皮細胞氧化損傷模型的建立*

彭 花，鄧穗平，談 金，蔣建偉，歐陽健明△

(暨南大學(xué)1生物礦化與結(jié)石病防治研究所，2醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

腎小管上皮細胞損傷是引起腎結(jié)石形成的重要原因之一。這些細胞受損后，由于基底膜直接暴露于管液中，有助于微晶的滯留和生長，成為結(jié)晶巢;此外，膜碎片在過飽和管液中還可促使異質(zhì)成核，甚至阻塞腎小管，產(chǎn)生了一個有利于晶體生長的環(huán)境，從而促進腎結(jié)石形成［1］。目前對腎石病機制的研究多采用細胞模型、動物實驗?zāi)Ｐ秃蜕锬つＰ汀＜毎Ｐ筒捎玫募毎抵饕衼碓从贖ampshire豬和美國負鼠的近曲小管細胞(LLC－PK1和OK－1)、來源于正常雄性矮腳長耳獵犬腎臟的集合管道和遠曲小管的細胞(MDCK－I和MDCK－II)［2］、來源于非洲綠猴和大鼠腎上皮細胞(BSC－1和NRK－52E)［3］以及犬和鼠腎髓質(zhì)集合管細胞(RCCD1［2］和IMCD);動物模型多采用誘導(dǎo)鼠腎損傷，建立損傷模型的方法［4］;生物膜模型則采用生物細胞膜的簡化模擬體系進行研究［5］。人類近端腎上皮細胞來源于人近端腎小管上皮細胞系(human kidney proximal tubule epithelial cell line，HKC)。研究表明，草酸、草酸鈣晶體以及自由基對HKC有損傷作用［6］。然而對HKC進行損傷，建立確切的損傷細胞模型還未報道。因此，損傷細胞模型的建立有助于從病理上研究泌尿系結(jié)石的形成機制。

材料和方法

1 材料和儀器

1.1 材料 HKC來源于上海長征醫(yī)院。培養(yǎng)液DMEMF12和新生牛血清(Gibco)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(大連美羅大藥廠)，細胞増生分析試劑盒(CCK－8)(日本同仁化學(xué)研究所)。其它常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器 XL－30型環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM，Philips);倒置熒光顯微鏡(IX51)(奧林巴斯公司);激光共聚焦熒光顯微鏡(510 META DUO SCAN，CARL Zeiss);酶標儀(Safire 2，Tecan)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HKC用含10%新生牛血清的DMEM－F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時加入100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。HKC傳代采用胰蛋白酶消化法。細胞達80%融合后用37℃的D－Hanks平衡液洗滌2次，加入0.25%胰酶消化液，37℃放置3～5 min后在倒置顯微鏡下觀察消化程度，當(dāng)細胞變圓，細胞之間出現(xiàn)孔隙且不再連接成片時，加入含10%新生牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液，終止消化，并吹打細胞脫離瓶壁形成單細胞懸液。

2.2 細胞活力檢測 將HKC懸液(濃度1×107cells/L)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL;孵育24 h后加入無血清的DMEM－F12孵育12 h，使細胞同步化。將孔板上的細胞分為2組，A組和B組。A組為空白組，只加入無血清培養(yǎng)液;B組為H2O2損傷組，加入含1 mmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)液對細胞進行損傷，損傷時間分別為 0、0.5、1、1.5、2 和 3 h。達到預(yù)定的損傷時間后，將2組細胞都改用新鮮的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK－8溶液，于37℃下孵育4 h后，用酶標儀在450 nm處測量吸光度A值，各個條件下的細胞平行測定3個重復(fù)孔，然后求A值的平均值，細胞活力=

2.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的檢測 按細胞濃度為5×107cells/L、500 μL/well將單細胞懸浮液接種于24孔培養(yǎng)板中。按照上面方法孵育及損傷細胞后，將細胞懸浮液移入EP管內(nèi)，在4℃離心10 min。取上清液，采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，用比色法分別在波長為532 nm和550 nm處測定MDA和SOD的吸光度A值。

2.4 細胞表面骨橋蛋白(osteopontin，OPN)檢測與定量 按細胞濃度為2×108cells/L、2 mL/well將單細胞懸浮液接種于6孔培養(yǎng)板中。細胞孵育及損傷達到預(yù)定時間后，吸除所有上清液，用PBS洗3次，每次5 min;加入4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS洗3次;加入羊血清封閉20 min，滴加兔抗人OPN抗體(sc－20788，Santa Cruz)(1∶150)，于37 ℃下孵育1 h，PBS洗3次。滴加FITC標記羊抗兔IgG抗體(sc－2012，Santa Cruz)(1∶100)，放于暗處，在 37℃下孵育 30 min，PBS充分沖洗3次。使用4'，6－二脒基－2－苯基吲哚(DAPI)封閉液(sc－24941，Santa Cruz)封片。對照組以兔血清代替OPN抗體。于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光。細胞核為藍色，骨橋蛋白顯綠色。實驗重復(fù)進行3次。

確定FITC綠色熒光定量條件后，F(xiàn)ITC熒光通道各條件不變(激發(fā)光波長:488 nm)，調(diào)節(jié)視野，拍攝一定數(shù)量的熒光圖片(10張左右)，使每個樣品的圖片中細胞總量在100個左右，運用Axio Vision Release 4.7軟件(Zeiss)分別計算各個細胞的熒光吸光度值，使用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計算熒光吸光度平均值。

2.5 細胞損傷前后形貌觀察 按細胞濃度為1×108cells/L接種于鋪有蓋玻片的12孔板中，每孔1 mL，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24 h后，加入無血清的DMEM－F12孵育12 h。吸除培養(yǎng)液，用D－Hanks洗滌細胞2次。將孔板上的細胞分為2組:A組為空白組;B組為損傷組，加入含H2O2(1 mmol/L)的無血清培養(yǎng)液。孵育一定時間(0、0.5、1、1.5、2、3 h)后，用PBS洗3次，2.5%的戊二醛于4℃固定24 h。然后于50%、70%、90%、100%乙醇中脫水，再用乙酸異戊酯固定后CO2臨界干燥樣品，噴金處理，掃描電子顯微鏡觀測細胞形貌及超微結(jié)構(gòu)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示。Tukey檢驗分析各實驗組與對照組均數(shù)間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H2O2對HKC活力的影響

通過檢測H2O2對HKC的增殖抑制作用，確定H2O2對HKC的損傷程度。用1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，細胞活力為(55.0±4.4)%，表明HKC已經(jīng)發(fā)生明顯的損傷(P＜0.05);作用1 h后，細胞活力顯著下降到(43.6±3.1)%;隨著H2O2作用時間的延長，對細胞的損傷進一步加劇，細胞活力進一步降低;作用2 h后，HKC活力為(40.0±3.6)%(P ＜0.05)，見圖1。

2 HKC損傷后的MDA含量和SOD活性變化

H2O2作用HKC 0.5 h后，MDA含量從對照組的(0.38±0.03)μmol/L上升到(1.00±0.08)μmol/L(P＜0.05)。隨著作用時間增加，MDA含量增加;當(dāng)作用2 h時，MDA含量達到最大值(1.48±0.08)μmol/L。

1 mmol/L H2O2作用HKC 0.5 h后，SOD活性明顯降低［(108.3±2.3)×103U/L vs(104.2±2.9)×103U/L，P＜0.05］。隨著H2O2作用細胞的時間分別增加到1和2 h后，SOD活性分別降至(102.7±2.2)×103U/L和(87.0±2.3)×103U/L(P ＜0.05)，見圖2。

3 HKC損傷后OPN的表達

正常HKC(0 h)周圍沒有或只有少量的OPN表達，1 mmol/L H2O2損傷0.5 h、1 h和2 h后，HKC周圍出現(xiàn)大量OPN表達(P＜0.05)，見圖3。

Figure 1.Cell viability of HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2 for different time..n=3.*P＜0.05 vs 0 h.圖1 1 mmol/L H2O2作用HKC不同時間后細胞活力的變化

Figure 2.Changes of MDA content and SOD activity in HKC after exposure to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖2 1mmol/L H2O2作用HKC不同時間后MDA含量和SOD活性的變化

Figure 3.Expression of OPN on the surface of HKC after exposurt to 1 mmol/L H2O2for different time..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖3 損傷前后HKC表面OPN的表達

4 細胞損傷前后形貌的變化

圖4為正常HKC和1 mmol/L H2O2損傷0.5、1、2 h后細胞形貌的SEM圖片。正常細胞形態(tài)飽滿、表面完整光滑，見圖4A;損傷1 h后，細胞干癟收縮，表面粗糙，其鞭毛、突觸大都斷裂脫落，見圖4C。

討 論

在生物體內(nèi)，腎上皮細胞在病理情況下通過非酶反應(yīng)與酶促反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基。而生物膜的主要成分磷脂含有不飽和脂肪酸，氧自由基對這些不飽和脂肪酸中的不飽和鍵具有很高的親和力，從而產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞損傷。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量的多少可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，也間接地反映出細胞受損傷的程度。雖然自由基會對機體產(chǎn)生諸多危害，但在一般的條件下人體細胞內(nèi)也存在著清除自由基的物質(zhì)，如抗氧化酶類，其中SOD是一種主要的抗氧化酶，可對抗氧自由基對細胞造成的損害。生物體內(nèi)SOD水平的降低意味著生物體抵抗自由基損傷的能力降低，反映機體受自由基損傷的程度。

Figure 4.SEM images of morphology of normal and injured HKC.A:normal cells;B:injury 0.5 h;C:injury 1 h;D:injury 2 h.Scale bar:5 μm.圖4 損傷前后HKC表面形貌的SEM照片

H2O2雖不是自由基，但它屬于活性氧類，有高反應(yīng)性，可促進自由基的生成，引發(fā)生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至滲入細胞內(nèi)部，破壞線粒體和DNA結(jié)構(gòu)，引起細胞壞死和凋亡［7］。我們的實驗結(jié)果表明，H2O2對HKC的氧化性損傷非常明顯，表現(xiàn)為細胞的增殖受到影響，細胞活力下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的釋放量增加，抗氧化酶SOD的水平下降。

從化學(xué)的觀點看，腎結(jié)石的形成與尿液中結(jié)石鹽的高度過飽和、抑制劑或促進劑的濃度和活性以及尿路細胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷等有關(guān)［8］。HKC受損傷后，細胞膜表面不但能為初始晶核的形成提供有效位點，而且增強了細胞膜與礦物質(zhì)的黏附，從而增加了腎結(jié)石形成的危險性［6］。以往研究表明，動物的腎小管上皮細胞損傷后，一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)晶體的黏附最大可增加 20 倍［9］;鳥糞石的附著力可增加5～6倍［10］。

正常細胞表面具有抗晶體黏附作用，當(dāng)細胞損傷之后，細胞的表面微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并表達大量能夠吸引鈣離子和草酸鈣晶體的帶負電荷的物質(zhì)，如透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)、膠原蛋白、OPN等。其中OPN的相對分子質(zhì)量約為44 kD，約含300個氨基酸殘基，其中帶負電荷的天冬氨酸與谷氨酸和不帶電的絲氨酸占總氨基酸量的一半。研究表明，溶液中游離的OPN能抑制草酸鈣晶體的成核、生長、聚集和對細胞的黏附;而細胞表面聚集的OPN則能促進晶體的黏附［11］。我們的實驗結(jié)果顯示，1 mmol/L H2O2損傷 HKC后，細胞表面表達了大量的OPN，并在1 h時達到最大(圖3)。位于細胞膜上OPN的量越多，促進晶體黏附的可能性就越大;而且，損傷后產(chǎn)生的細胞碎片也可以促進晶核的形成。因此，HKC損傷后，可加速并促進晶體的生長和黏附，最終導(dǎo)致腎結(jié)石形成。

本文研究了H2O2對培養(yǎng)的HKC的致?lián)p傷作用。HKC損傷后，細胞活力和SOD濃度下降，MDA含量上升，細胞膜表面的微絨毛斷裂與脫落，且在膜上表達能夠黏附尿石礦物的蛋白分子OPN。因此，用1 mmol/L H2O2作用HKC 1 h所建立的氧化損傷模型，有助于從細胞水平和分子水平上闡明腎結(jié)石形成的病理和形成機制。

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