右美托咪定對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響*

劉付寧，紀(jì)風(fēng)濤，何惠燕，梁建軍，劉 玲，曹銘輝△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1麻醉科，2供應(yīng)中心，廣東 廣州 510120)

腦血管病是當(dāng)今影響人類健康及致死、致殘的主要疾病之一，其中以缺血性腦血管病最為常見。對(duì)缺血腦組織進(jìn)行及時(shí)再灌注是治療腦卒中的有效措施，但再灌注會(huì)引起腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷時(shí)，神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用對(duì)神經(jīng)元的存活具有重要作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類細(xì)胞，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的主要構(gòu)成成分，對(duì)維持神經(jīng)元微環(huán)境的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)代謝過程起重要作用［1-2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后非常活躍，主要表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達(dá)水平升高，并且合成多種炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致大腦神經(jīng)組織損傷［3］。在星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種炎癥因子中，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是炎癥反應(yīng)的主要致炎因子，在細(xì)胞因子的釋放順序中處于源頭，參與了腦缺血后炎癥與細(xì)胞死亡的過程［4］。

鹽酸右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種新型高選擇性的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，于2009年6月在我國(guó)上市。它除了具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮作用，還具有抗交感、抑制應(yīng)激反應(yīng)、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)和減少麻醉藥用量作用等，目前已廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)領(lǐng)域。最近研究發(fā)現(xiàn)DEX具有腦保護(hù)作用，但具體作用機(jī)制目前研究很少。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEX對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞具有調(diào)控作用［5］，但是DEX能否通過調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞達(dá)到腦保護(hù)作用目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬在建立局灶腦缺血/再灌注模型，通過觀察DEX對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，探討DEX在腦保護(hù)中的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

SPF級(jí)SD大鼠，雌性，體重220～250 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;DEX購(gòu)自恒瑞制藥，GFAP單克隆抗體購(gòu)自Neomarkers;TNF-α多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma;HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgGⅡ抗購(gòu)自Amersham。TBST配制抗體稀釋液和Western blotting化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

2 動(dòng)物選擇和分組

健康雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham 組)、缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion，I/R組)、DEX1組(缺血前30 min腹腔給予DEX 20 μg/kg)和DEX2組(缺血前30 min腹腔給予DEX 40 μg/kg)。

3 動(dòng)物模型制作

SD大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，動(dòng)物模型制作參考Longa等［6］的制作方法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉后，分離出右側(cè)頸外動(dòng)脈，以尼龍線栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈，栓線深度18～20 mm，阻斷2 h后再灌注，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血/再灌注模型。大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分:無明顯神經(jīng)功能缺失為0分;左側(cè)前爪不能伸直為1分;行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分;行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒者為3分;不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者為4分。

4 給藥

DEX1組和DEX2組給藥如前所述;I/R組給予等量的生理鹽水，sham組只作切口和動(dòng)脈分離手術(shù)，但不行腦缺血再灌注。

5 HE染色

大鼠在缺血24 h后，以10%水合氯醛腹腔注射將其麻醉，開胸經(jīng)心臟灌流生理鹽水，然后輸注4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死最大層面，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅染色。在4倍鏡下觀測(cè)缺血區(qū)面積，經(jīng)圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)處理得出各組的平均缺血面積。

6 免疫組織學(xué)觀察

各組SD大鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，將腦組織迅速置-80℃冷凍并保存。-20℃恒冷切片機(jī)于自額極至枕葉分為5等份，取第3片腦片范圍內(nèi)連續(xù)切片(厚4 μm)，冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定10 min，3%H2O2室溫10 min;0.01 mmol/L PBS浸泡 3次，5 min/次，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫。正常山羊血清液封閉10 min，滴加抗小鼠GFAP單克隆或TNF-α多克隆抗體，4℃過夜;滴加生物素標(biāo)記抗小鼠Ⅱ抗，37℃孵育20 min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素，37℃孵育20 min;DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。常規(guī)設(shè)立陰性對(duì)照，以缺血病灶為觀察部位，400倍光鏡下隨機(jī)選擇不重疊10個(gè)海馬區(qū)視野，以胞漿和突起呈棕黃色的細(xì)胞為GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，以胞漿、胞膜呈棕黃色的細(xì)胞為TNF-α陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，每組5只大鼠，每只大鼠隨機(jī)選取5張非連續(xù)切片，計(jì)算每只大鼠平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

7 蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)的GFAP表達(dá)的變化

大鼠斷頭處死后迅速取出右側(cè)大腦組織，用預(yù)冷PBS液沖去表面血跡，置冰盤上快速分離右側(cè)頂葉皮質(zhì)，取大鼠大腦組織1 mg加入10 mL體積的比例加入蛋白裂解液，冰上裂解、勻漿，5000 r/min離心15 min，提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入Ⅰ抗孵育過夜。加入標(biāo)記辣根過氧化物酶的抗鼠/兔的IgGⅡ抗，室溫下孵育1 h，ECL顯色，掃描后用Image J軟件分析系統(tǒng)定量，計(jì)算灰度值，以β-actin灰度值進(jìn)行校正，再以sham組為100%進(jìn)行校正，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能行為評(píng)分

缺血/再灌注后各組大鼠均出現(xiàn)了不同程度神經(jīng)功能損害癥狀，神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于sham組，與I/R組比較，DEX1組和DEX2組神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯降低，見表1。

表1 DEX對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺失評(píng)分和梗死面積的影響Table 1.Effects of DEX on neurological deficiency scores and infarct size in rats with ischemia/reperfusion(.n=6)

表1 DEX對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺失評(píng)分和梗死面積的影響Table 1.Effects of DEX on neurological deficiency scores and infarct size in rats with ischemia/reperfusion(.n=6)

★P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs DEX1.

Sham 0 0 I/R 3.89±0.45★ 1.70±0.31★DEX1 2.13±0.38★△ 1.21±0.23★△DEX2 2.03±0.51★△ 1.06±0.07★△#

2 HE染色

光鏡下見sham組大鼠腦組織細(xì)胞排列有序，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元核圓形，邊界及核仁清晰，胞漿染色均勻淡染，胞膜完整;I/R組大鼠腦組織有缺血性損傷改變，缺血區(qū)擴(kuò)展到整個(gè)大腦中動(dòng)脈供應(yīng)區(qū)，其腦組織著色淺，細(xì)胞染色淡，數(shù)量明顯減少，與正常腦組織有過渡區(qū)，細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞胞體縮小，胞核固縮，染色質(zhì)濃縮，缺血邊緣區(qū)也表現(xiàn)為水腫;DEX1組和DEX2組也可見缺血性損傷改變，但面積較I/R組相應(yīng)減小，細(xì)胞水腫較輕，變性壞死數(shù)量較少。與DEX1組比較，DEX2組腦梗死面積減小，見圖1、表1。

Figure 1.The pathological changes of the brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(HE staining，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖1 各組大鼠大腦組織HE染色

3 免疫組織學(xué)改變

3.1 免疫組織學(xué)檢測(cè)GFAP表達(dá)變化 在sham組大腦，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)較少，細(xì)胞淡染，胞體小，突起細(xì)少，纖維排列呈放射狀，GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞少;I/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)明顯增多，染色呈深棕黃色，胞體肥大，突起粗大不規(guī)則，GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，呈強(qiáng)陽(yáng)性;而DEX1組和DEX2組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)多于sham組，但比I/R組減少，胞體形態(tài)趨于正常，GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞也相應(yīng)減少，見圖2。

3.2 各組大鼠GFAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 腦缺血再灌注后I/R組腦組織內(nèi)有較多細(xì)胞表達(dá)GFAP，腦缺血后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較sham組顯著增多(P＜0.05)，DEX預(yù)處理后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較I/R組顯著減少(P＜0.05)，且DEX2組比DEX1組減少更顯著(P ＜0.05)，見表2。

3.3 免疫組織學(xué)檢測(cè)TNF-α表達(dá)變化 Sham組大鼠腦組織偶然可以看到零散分布的TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞，均為神經(jīng)元樣細(xì)胞。I/R組梗死區(qū)TNF-α陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞增多，同時(shí)TNF-α陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，呈強(qiáng)陽(yáng)性。而DEX預(yù)處理組TNF-α陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞多于sham組，但比I/R組減少，見圖3。

3.4 各組大鼠TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 與sham組比較，腦缺血再灌注后I/R組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，而DEX預(yù)處理后TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較 I/R組顯著減少(P＜0.05)，并且DEX2組比DEX1組減少更顯著(P＜0.05)，見表2。

Figure 2.Effects of DEX on GFAP-labeled cells in ischemic area of brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(DAB，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖2 DEX對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)大腦GFAP表達(dá)的影響

Figure 3.Effects of DEX on TNF-α-labeled cells in ischemic area of brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(DAB，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖3 DEX對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)大腦TNF－α表達(dá)的影響

表2 星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP和TNF－α蛋白的計(jì)數(shù)Table 2.Counting of astrocytes expressing TNF-α and GFAP proteins in rats(.n=6)

表2 星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP和TNF－α蛋白的計(jì)數(shù)Table 2.Counting of astrocytes expressing TNF-α and GFAP proteins in rats(.n=6)

★P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs DEX1.

Group GFAP TNF-α Sham 13.39±1.40 1.06±0.09 I/R 34.84±3.45★ 7.10±2.51★DEX1 23.26±2.57★△ 3.48±0.47★△DEX2 19.71±4.52★△# 3.06±0.64★△#

4 Western blotting檢測(cè)DEX預(yù)處理對(duì)GFAP表達(dá)的影響

GFAP蛋白表達(dá)水平在缺血再灌注組24 h后明顯升高，DEX預(yù)處理后，GFAP表達(dá)水平比缺血再灌注組顯著降低，且以DEX2組效果更加明顯。

Figure 4.Effects of DEX on the expression of GFAP in rats..n=6.*P ＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs I/R;#P ＜0.05 vs DEX1.圖4 DEX對(duì)大鼠腦缺血再灌注后缺血側(cè)大腦皮層GFAP表達(dá)的影響

討 論

腦血管病變是臨床多發(fā)病、常見病。近年來，其發(fā)病率、致死率和致殘率有上升趨勢(shì)，成為目前臨床上致殘、致死的主要原因，其中又以缺血性腦血管病變最為常見。缺血性腦血管病變特別是腦缺血后的再灌注損傷，危害大，其相關(guān)機(jī)制的研究一直是臨床和基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)。目前，對(duì)于腦缺血/再灌注損傷機(jī)制的研究主要集中在興奮性神經(jīng)毒性、氧化損傷、炎癥反應(yīng)、Ca2+超負(fù)荷等方面，其中，缺血再灌注時(shí)的炎癥反應(yīng)是腦缺血/再灌注損傷的主要機(jī)制之一［7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后非常活躍，主要表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，GFAP表達(dá)水平升高，并且合成多種炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致大腦神經(jīng)組織損傷［1-2］。因此，我們采用DEX作為干預(yù)手段，通過觀察其對(duì)缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，探討其對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)的可能機(jī)制。GFAP是一種中間絲蛋白，作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架，同時(shí)它也是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的一種標(biāo)志蛋白，參與維持神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和血腦屏障的功能。在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后除了膠質(zhì)細(xì)胞胞體的增生、肥大，同時(shí)也出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)增強(qiáng)的現(xiàn)象，并且其表達(dá)水平與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活程度密切相關(guān)［8-10］。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血再灌注24 h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)量增加，這與Rom?o等［11］的研究結(jié)果一致。

DEX是一種新型高選擇性α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，在我國(guó)上市后，由于它除了具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮作用，還具有抗交感、抑制應(yīng)激反應(yīng)、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)和減少麻醉藥用量等多方面作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)領(lǐng)域。DEX主要藥理作用主要是通過激活腦干藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元α2受體后，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用;并抑制下行延髓-脊髓去甲腎上腺素能通路突觸前膜P物質(zhì)和其它傷害性肽類的釋放，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［12-13］。這說明 DEX對(duì)神經(jīng)元興奮性具有抑制作用。但DEX對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究很少，特別是DEX對(duì)缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)DEX 20 μg/kg或 DEX 40 μg/kg明顯抑制了缺血再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和TNF-α的表達(dá)增加，并且以DEX 40 μg/kg效果更加明顯，提示DEX可能對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活有直接抑制作用。一方面有研究發(fā)現(xiàn)α2受體不但分布于中樞去甲腎上腺素能神經(jīng)元突觸前膜，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞膜也有分布［14］;另一方面，Chen 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞加入DEX后細(xì)胞內(nèi)CO2生成增加，氧化代謝增強(qiáng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞間隙谷氨酸的清除能力增加，細(xì)胞外谷氨酸含量減少，谷氨酸激活星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活減少。

近年來，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和缺血再灌注損傷的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。一方面，腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，其對(duì)細(xì)胞間隙的谷氨酸及H+、K+等清除能力增加，釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子增多，有助于腦缺血后受損神經(jīng)元的修復(fù);另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活影響受損神經(jīng)元修復(fù)和功能恢復(fù)，同時(shí)通過釋放谷氨酸造成興奮性氨基酸毒性、釋放炎癥因子等，加重神經(jīng)元的損傷。目前，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血再灌注過程中發(fā)揮保護(hù)或損傷作用的時(shí)間及深入機(jī)制尚未明確，還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEX對(duì)大腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活、減少星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α等炎癥因子有關(guān)。

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