慢病毒介導(dǎo)的c－met RNA干擾對人乳頭狀甲狀腺癌K1細胞生物學(xué)行為的影響*

鄭時玉，王 麗，劉澤兵，桂 律

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院病理科，上海 201508)

c－Met是由c－met原癌基因編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，與其配體肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)結(jié)合后，發(fā)生自身磷酸化，進而通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細胞發(fā)生各種生物學(xué)反應(yīng)［1］。已有不少研究證實c－Met在乳頭狀甲狀腺癌中高表達，并與其病理分期、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，它能介導(dǎo)序列高度同源的靶基因的mRNA降解，從而特異而有效地阻斷靶基因的表達。而慢病毒介導(dǎo)的RNAi具有對分裂和非分裂細胞均有感染作用、容納外源性基因片段大、感染后可以整合到受感染細胞的基因組進行長時間的穩(wěn)定表達等特點。本研究旨在探討慢病毒RNAi載體阻斷HGF/c－Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后對乳頭狀甲狀腺癌細胞生長、遷移、侵襲等的作用。

材料和方法

1 材料

Lipofectamine 2000購自Invitrogen;SuperReal PreMix(SYBR Green)購自天根生化;β－actin和c－Met I抗購自Santa Cruz;羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購自優(yōu)寧維公司;Transwell小室購自 Corning;DMEM/F12購自HyClone;BALB/c裸鼠購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。

2 方法

2.1 免疫組化 檢測組織取自2007年～2009年間在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院實施手術(shù)切除的35例乳頭狀甲狀腺癌標(biāo)本和25例良性甲狀腺疾病標(biāo)本(包括甲狀腺腺瘤10例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15例)。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定。免疫組化檢測用EnVision二步法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS緩沖液代替I抗作為陰性對照。

2.2 細胞系及細胞培養(yǎng) 人乳頭狀甲狀腺癌K1細胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬二院提供，并常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中;培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.3 RNAi慢病毒載體的制備 根據(jù)siRNA設(shè)計原則及人類 met基因 mRNA序列(GenBank_id NM_001127500)設(shè)計了2條針對met基因的RNAi靶點序列，即 c－met1:GCACGATGAATACATTGAAAT，c－met2:TCAACTTCTTTGTAGGCAATA。針對靶位點分別設(shè)計2條互補的寡核苷酸序列，將合成好的單鏈DNA退火形成雙鏈DNA Oligo，與經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切回收好的PGCSIL－GFP載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性重組菌落送上海吉凱基因測序。

2.4 RNAi慢病毒包裝及滴度測定 用 Lipofectamine 2000將3種質(zhì)粒(PGCSIL－GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0)共轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的上清液，采用逐孔稀釋法測定慢病毒滴度。

2.5 慢病毒感染 K1細胞 慢病毒以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50感染細胞，加入Polybrene至終濃度為5 mg/L;96 h后，熒光顯微鏡下觀察感染效率，繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

2.6 實時熒光定量PCR 采用SYBR Green法，cmet上游引物 5’－TCTGCCTGCAATCTACAAGG－3’，下游引物 5’－ATTATTCCTCCGAAATCCAAAGT－3’;β－actin上游引物5’－AGAGCTACGAGCTGCCTGAC－3’，下游引物5’－CGTGGATGCCACAGGACT －3’。

2.7 Western blotting 用10%SDS－PAGE凝膠電泳分離蛋白，I抗稀釋為1∶200，Ⅱ抗稀釋為1∶3000。

2.8 克隆形成實驗 細胞以200 cells/well接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)14 d，經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色后，記錄含有50個細胞以上的克隆數(shù)量。

2.9 流式細胞術(shù)測量細胞周期 用胰酶消化細胞，離心沉淀，再用預(yù)冷的PBS混懸細胞，離心沉淀，加入70%乙醇4℃固定24 h，再次離心沉淀，每管加入碘化丙啶染色液，染色完成后24 h內(nèi)用流式細胞術(shù)檢測。

2.10 劃痕實驗 細胞以5×104cells/well的密度接種于24孔板中，待接近形成細胞單層時，用200 μL的槍頭在24孔板內(nèi)均勻劃直線，更換含1%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.11 Transwell侵襲實驗 采用 24孔 Transwell(8.0 μm濾膜微孔孔徑)系統(tǒng)。小室內(nèi)加入40 μL基質(zhì)膠(matrigel)(1∶4稀釋)，用含 0.5%BSA 的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×108cells/L，取200 μL細胞懸液加入小室內(nèi)，下室加入1000 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去小室上表面的細胞，固定，結(jié)晶紫染色。

2.12 裸鼠皮下成瘤實驗 將18只6周齡BALB/c雌性裸鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組，每組6只，飼養(yǎng)在上海市公共衛(wèi)生動物中心;選用沉默效果最佳的K1－cmet－sh2進行實驗;將3組細胞用無血清培養(yǎng)基重懸為密度1×1010/L的懸液，在裸鼠腋窩中部外側(cè)皮下注射0.2 mL的細胞懸液。接種后，定期觀察各組成瘤情況，腫瘤體積計算公式:(長×寬2)/2。接種30 d后斷頸處死裸鼠，從皮下剝離出腫瘤組織。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗進行率的比較;計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差()表示，組間差異顯著性檢驗采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組化結(jié)果

c－Met蛋白染色定位于甲狀腺細胞的細胞漿，見圖1，陽性為棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細胞所占百分比大致分為:陰性(－)，未發(fā)現(xiàn)陽性瘤細胞;弱陽性(+)，陽性細胞≤5%;中陽性(++)，陽性細胞5%～20%;強陽性(+++)，陽性細胞＞20%。其中將陰性(－)及弱陽性(+)歸為低表達組，中陽性(++)及強陽性(+++)歸為高表達組［3］。乳頭狀甲狀腺癌c－Met蛋白表達明顯高于良性甲狀腺病(P＜0.05)，見表1。

2 重組慢病毒載體測序結(jié)果

將重組慢病毒載體分別命名為PGC－met1－shRNA、PGC－met2－shRNA和PGC－NC－shRNA，其中PGC－NC－shRNA由上海吉凱基因提供。結(jié)果顯示根據(jù)RNAi靶位合成的雙鏈DNA核苷酸序列成功插入PGCSIL－GFP載體質(zhì)粒的Age I和EcoR I的酶切位點，說明c－met RNAi載體構(gòu)建成功，見圖2。

Figure 1.The expression of c－Met protein detected by immunochemistry(×200).A:papillary thyroid cancer;B:benign thyroid disease.圖1 免疫組化檢測乳頭狀甲狀腺癌中c－Met的表達

表1 c－Met在乳頭狀甲狀腺癌與良性甲狀腺病變中的表達情況Table 1.The expression of c－Met in papillary thyroid carcinoma and benign thyroid disease

Figure 2.The sequence maps of the recombinant plasmids.圖2 重組質(zhì)粒測序圖譜片段

3 重組慢病毒感染K1細胞的效率

將細胞分為4組:K1－CON(空白對照組即未感染慢病毒的細胞)、K1－NC(陰性對照組即感染PGC－NC－shRNA慢病毒的細胞)、K1－cmet－sh1(感染PGC－met1－shRNA慢病毒的細胞)和K1－cmet－sh2(感染PGC－met2－shRNA慢病毒的細胞)。重組慢病毒(MOI=50)感染K1細胞96 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，見圖3，結(jié)果顯示K1－NC、K1－cmet－sh1和K1－cmet－sh2組慢病毒的感染效率分別為93.3%、92.5%和89.5%。

Figure 3.GFP expression examined using fluorescent microscopy(×40).圖3 熒光顯微鏡觀察各組細胞GFP表達情況

4 重組慢病毒感染K1細胞后c－met mRNA和蛋白表達

慢病毒感染細胞96 h后，分別用熒光定量PCR及Western blotting檢測各組細胞c－met mRNA及蛋白表達情況，以β－actin為內(nèi)參照。熒光定量PCR采用2－ΔΔCt法計算 c－met mRNA 的相對表達量，結(jié)果見圖4。K1－cmet－sh1和K1－cmet－sh2組細胞c－met mRNA水平與 K1－NC組相比分別下降65.8%和81.7%，K1－cmet－sh1組與 K1－NC組比較、K1－cmet－sh2組與K1－NC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而K1－NC組與K1－CON組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 4.The effect of c－met RNAi lentivirus on c－met mRNA expression in K1 cells..n=3.*P＜0.05 vs K1－CON or K1－NC.圖4 c－met RNAi慢病毒對K1細胞c－met mRNA表達的影響

Western blotting結(jié)果見圖5。K1－cmet－sh1和K1－cmet－sh2組細胞c－Met蛋白水平與K1－NC組相比分別下降40.6%和69.3%，K1－cmet－sh1組與K1－NC組比較、K1－cmet－sh2組與K1－NC組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而K1－NC組與K1－CON組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果都表明重組慢病毒介導(dǎo)的RNAi能成功下調(diào)c－met表達。

Figure 5.The effect of c－met RNAi lentivirus on c－met protein expression in K1 cells.圖5 c－met RNAi慢病毒對K1細胞c－met蛋白表達的影響

5 重組慢病毒感染K1細胞后細胞克隆形成能力的變化

克隆形成實驗結(jié)果見圖6。顯微鏡下觀察計數(shù)，記錄含有50個細胞以上的克隆數(shù)，計算細胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù) ×100%。結(jié)果顯示 K1－cmet－sh2組(11.5% ±1.3%)的克隆形成率明顯小于K1－NC組(17.5% ±1.0%)和 K1 －CON 組(18.6% ±1.2%)，K1 －cmet－sh2組較K1－NC組的克隆形成率降低34.3%，K1－cmet－sh2組與 K1－NC組、K1－cmet－sh2組與K1－CON組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。但K1－NC組與K1－CON組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 6.The effect of c－met RNAi lentivirus on colony formation activity of K1 cells.圖6 c－met RNAi慢病毒對K1細胞克隆形成能力的影響

6 重組慢病毒感染K1細胞后細胞周期的改變

K1－cmet－sh2組 S期細胞(19.53% ±2.56%)較 K1－CON 組(40.85% ±5.56%)和 K1－NC組(36.75% ±5.32%)都有所較少，且有顯著差異(P＜0.05)，而 K1－CON 組(40.85% ±5.56%)與 K1－NC組(36.75% ±5.32%)相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖 7。

Figure 7.The effect of c－met RNAi lentivirus on cell cycle of K1 cells.圖7 c－met RNAi慢病毒對K1細胞細胞周期的影響

7 重組慢病毒感染K1細胞后細胞遷移能力的改變

劃痕實驗結(jié)果見圖8。分別測量0 h和48 h的劃痕寬度，平均遷移距離=(0 h的劃痕寬度－48 h的劃痕寬度)/2。結(jié)果顯示 K1－cmet－sh2組［(146.2±16.6)μm］平均遷移距離小于 K1－NC 組［(210.8±19.7)μm］和 K1 －CON 組［(213.6 ±20.2)μm］，K1－cmet－sh2組較K1－NC組的平均遷移距離減少30.6%，K1－cmet－sh2組與K1－NC組、K1－cmet－sh2組與K1－CON組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但K1－NC組與K1－CON組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 8.The effect of c－met RNAi lentivirus on migrative activity of K1 cells(×40).圖8 c－met RNAi慢病毒對K1細胞遷移能力的影響

8 重組慢病毒感染K1細胞后細胞侵襲能力的改變

倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野，Transwell實驗結(jié)果見圖9，結(jié)果顯示 K1－cmet－sh2組［(11.4±1.9)個］細胞數(shù)明顯小于K1－NC組［(16.4±1.9)個］和K1－CON組［(17.2±2.1)個］，K1－cmet－sh2組較 K1－NC 組的遷移細胞數(shù)減少30.5%，K1－cmet－sh2組與K1－NC組、K1－cmet－sh2組與K1－CON組兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但K1－NC組與K1－CON組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 9.The effect of c－met RNAi lentivirus on invasive activity of K1 cells(×100).圖9 c－met RNAi慢病毒對K1細胞侵襲能力的影響

9 裸鼠成瘤實驗

接種8 d后陰性對照組可見腫瘤長出，接種20 d后RNAi組見腫瘤長出。接種30 d后將裸鼠處死，見圖10。RNAi組的腫瘤體積［(35.0 ±3.2)mm3］明顯小于陰性對照組［185.0±12.6)mm3］(P ＜0.05)。

Figure 10.The effect of c－met RNAi lentivirus on the tumor growth of subcutaneous implantation in the nude mice.圖10 c－met RNAi慢病毒對裸鼠皮下抑制瘤生長的影響

討 論

乳頭狀甲狀腺癌是甲狀腺癌中最常見的類型，青少年、女性多見，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較早，雖然絕大多數(shù)病人經(jīng)手術(shù)、放射碘等治療后預(yù)后較好，但仍有少數(shù)病人會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，因此尋找一種新的治療方法已成為一個重要課題。而慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾就是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，能特異而有效、穩(wěn)定地阻斷靶基因的表達。

c－Met是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，它與HGF結(jié)合后，胞內(nèi)區(qū)發(fā)生自身磷酸化，從而激活下游的PI3K/AKT、MEK/MAPK信號通路，導(dǎo)致細胞發(fā)生增殖、侵襲等生物學(xué)反應(yīng)［4－6］。c－Met在不同的腫瘤中可以以點突變、基因移位、基因擴增、過度表達、和HGF形成自分泌環(huán)等方式發(fā)揮作用，引起促腫瘤細胞增殖、抗凋亡、促侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。已有不少研究證實c－Met在乳頭狀甲狀腺癌中高表達，并與其病理分期、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此猜測c－Met參與了甲狀腺癌發(fā)生與發(fā)展的過程，理論上阻斷腫瘤細胞c－Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路就有可能減低細胞增殖、遷移、侵襲等能力從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。而目前國內(nèi)尚未見慢病毒介導(dǎo)的c－met RNAi的用于甲狀腺癌方面的研究。

克隆形成能力反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要特征，更傾向于反映腫瘤細胞的“接觸不抑制”特征［7］，是反映腫瘤惡性程度的手段。張盛周等［8］用腺病毒介導(dǎo)c－met RNAi后抑制了肝癌細胞的克隆形成能力。在本實驗中我們應(yīng)用克隆形成實驗檢測了下調(diào)c－met后細胞克隆形成能力的變化，結(jié)果顯示細胞的克隆形成能力減低。

姬長友等［9］下調(diào) c－met后，喉癌 Hep－2細胞的遷移侵襲能力降低;Wang等［10］下調(diào)肺小細胞癌SCLC細胞的c－met后，細胞遷移侵襲能力減低;Chu等［11］下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞的 c－met后，細胞侵襲能力也減低。由此我們推測下調(diào)甲狀腺癌細胞c－met后細胞的遷移侵襲能力也將會有所減低。在本實驗中，我們運用劃痕實驗和Transwell實驗檢測體外細胞的遷移侵襲能力，而Transwell小室是目前最為理想的模擬體外細胞侵襲的模型，結(jié)果顯示下調(diào)c－met后細胞的遷移侵襲能力都降低，與我們之前預(yù)測的相符。

細胞周期調(diào)控機制的紊亂是腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要因素。細胞周期主要由細胞周期素和細胞周期依賴性激酶形成的復(fù)合物進行調(diào)節(jié)，此復(fù)合物的激活和失活可調(diào)控細胞周期不同時期之間的轉(zhuǎn)換，其中G1－S和G2－M期的轉(zhuǎn)換為2個關(guān)鍵的檢查點［12］。許多基因的突變或失活均可導(dǎo)致細胞周期的失調(diào)。在本實驗中，我們運用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，結(jié)果顯示 c－met下調(diào)后，細胞周期的進程減慢。

為了證實細胞在體內(nèi)的生長狀況，我們將cmet下調(diào)后的細胞接種到裸鼠體內(nèi)，觀察其對K1細胞成瘤能力的影響，結(jié)果顯示c－met下調(diào)后的細胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低。

綜上所述，通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi可以有效降低甲狀腺癌K1細胞c－met的表達，這種c－met的下調(diào)能夠抑制細胞的克隆形成、細胞周期進程、遷移侵襲能力和成瘤能力，由此推測，c－met可能成為未來診斷和治療甲狀腺癌的潛在靶點，這也為臨床上對乳頭狀甲狀腺癌進行基因治療提供了理論依據(jù)。

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