骨肉瘤組織中Skp2、p27蛋白的表達變化及意義

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011)

Skp2是細胞增殖的重要調控蛋白，研究發現Skp2表達與大多數惡性腫瘤的發生、進展、轉移及預后有密切關系。p27為一種參與細胞周期調控的重要抑癌基因，其通過調控活化細胞周期素依賴性激酶-2所需的細胞周期素E的閾值來抑制細胞增殖。研究發現［1］，Skp2和p27蛋白在惡性腫瘤組織中的表達呈負相關，兩者從相反方面調控細胞周期素激酶活性。2008年6月～2011年6月，本研究采用免疫組化SP法檢測了人骨肉瘤組織及正常骨組織中的Skp2和p27蛋白，探討兩者在骨肉瘤中的表達特點及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤組40例均為河北醫科大學第四醫院手術切除并病理存檔的骨肉瘤石蠟標本。患者中男27例，女13例，年齡11～39歲，平均21歲。其中成骨肉瘤30例，軟骨肉瘤10例;低分化16例，高分化24例;有淋巴結轉移17例，無淋巴結轉移23例。所有病例術前均未接受放化療。另選40例正常骨組織為對照組，均來源于手術治療的骨折患者，患者中男30例，女10例，年齡13～42歲，平均23歲。兩組患者性別、年齡相比，P均＞0.05。

1.2 主要試劑 鼠抗人Skp2和p27單克隆抗體，免疫組化染色試劑盒(SP盒)及DAB-HCL顯色試劑盒。

1.3 Skp2和p27蛋白的檢測 采用免疫組化SP法。每例石蠟標本以4 μm切片，常規脫蠟，微波修復抗原，3%H2O2處理10 min以抑制內源性過氧化物酶活性。正常羊血清處理15 min，一抗4℃孵育過夜，生物素標記的二抗處理15 min，鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶復合物處理15 min，DAB顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知免疫組化陽性切片作陽性對照。

1.4 結果判定 以胞質內出現明顯棕黃色顆粒者為Skp2和p27蛋白表達陽性細胞，顯微鏡下(×40)觀察，每片選8個不重復的高倍視野，計算陽性細胞占細胞總數的百分比，取其均值。以陽性細胞百分比≥25%為Skp2、p27蛋白表達陽性、＜25%為陰性。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。采用四格表法進行相關性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組與對照組Skp2、p27蛋白表達比較骨肉瘤組中Skp2蛋白表達陽性27例，p27蛋白陽性12例，對照組中分別為13、25例，兩組相比，P均＜0.05。

2.2 Skp2、p27蛋白表達與骨肉瘤臨床病理參數的關系 Skp2蛋白表達與骨肉瘤組織類型、分化程度、淋巴結轉移有關(P均＜0.05);p27蛋白表達與骨肉瘤組織類型、分化程度有關(P均＜0.05)，與淋巴結轉移無關(P＞0.05)。詳見表1。

2.3 骨肉瘤組織中Skp2、p27蛋白表達的相關性骨肉瘤組織Skp2蛋白表達陽性的27例中，有p27蛋白陽性12例(陽性符合率為44.4%);Skp2蛋白表達陰性13例中，有p27蛋白陰性2例(陰性符合率為15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達呈負相關關系(r= －0.34，P＜0.05)。

3 討論

Skp2是一種F-box蛋白，有四個亞單位，是調節細胞周期G1/S期過渡的關鍵。Skp2的過度表達可以促進腫瘤的發生、侵襲和轉移，而缺乏則可對腫瘤起到抑制作用［2］。Skp2通過G/S轉換“關卡”促進細胞周期的進展［3］，從而促進DNA的復制、細胞增殖，因此Skp2基因被認為是一種原癌基因，具有癌基因功能。Skp2應用于人類腫瘤檢測時，是不良預后的標志之一。其作為F-box蛋白成員之一，在人感細胞生長因子(SCF)復合體中能夠特異識別蛋白底物，降低細胞周期蛋白p27、p21等的表達，使S期細胞增加，抗凋亡能力增強［4］。有學者研究發現，Skp2陽性表達者與陰性表達者相比，惡性腫瘤進展更快，更易發生轉移和復發，并且預后差，因此認為Skp2可作為評估惡性腫瘤預后的重要生物學標記［5］。本研究結果也顯示，Skp2在骨肉瘤組織中的陽性表達率較正常骨組織明顯升高。

表1 Skp2、p27蛋白表達與骨肉瘤臨床病理參數的關系

Skp2可通過泛素化或者降解底物如p27來調節細胞周期和細胞增殖［5］。研究表明，Skp2在腫瘤的移行、侵襲和轉移中起到直接作用［6］。Skp2在單獨缺乏時不會誘導細胞凋亡，但聯合缺乏腫瘤抑制蛋白(ARF)或磷酸酶抑癌基因(PTEN)時可以誘導細胞凋亡［7］。Skp2缺乏者腫瘤細胞轉移會受到嚴重影響，而Skp2高表達則可大大促進細胞的移行和轉移。RAS基因同源基因A家族(RhoA)與腫瘤細胞的轉移有關。在Skp2缺乏的細胞，RhoA mRNA及蛋白水平都會極大降低，而在Skp2過度表達時RhoA mRNA及蛋白水平會相應增加［8］，提示Skp2抑制細胞轉移可能是通過RhoA來實現的。本研究中，40例骨肉瘤患者中有27例Skp2表達陽性，且其在成骨肉瘤、有淋巴結轉移者、低分化者中的陽性表達率分別高于軟骨肉瘤、無淋巴結轉移者、高分化者，表明Skp2陽性表達者腫瘤惡性程度高、進展快，易發生轉移和復發并且預后差，與相關研究結果一致。

p27是一種廣譜的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白［9］。作為一種參與細胞周期調控的重要抑癌基因，它直接參與細胞的生長抑制、分化等調控過程，其表達下調會導致細胞周期調控紊亂［10］。p27與細胞的分化有關，過度表達抑制細胞的分裂，表達不足促進腫瘤的發生［11］。研究表明，p27很少或不發生基因突變，對細胞周期的調控主要通過其蛋白的表達水平及活性改變。在多種腫瘤中可發現p27表達下降，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌。p27能通過抑制依賴細胞周期素激酶(如cdk-1、cdk-2和cdk-4/6)，抑制G0/G1的轉變，從而抑制細胞增殖［12］。有學者研究發現，部分惡性腫瘤組織中p27蛋白及其mRNA呈陰性表達，而其相應正常組織及良性病變組織中p27多呈陽性表達，這說明p27高表達有助于抑制腫瘤的發生，低水平的p27與惡性腫瘤轉移和不良預后相關［13］。本研究40例骨肉瘤患者中有12例p27表達為陽性，且其在惡性程度較低的軟骨肉瘤及高分化者中表達陽性率更高，證實了上述觀點。

大量研究表明Skp2與p27蛋白表達水平呈負相關關系［14］，Skp2能夠降低p27蛋白表達，促使細胞由G1期進入S期，抗細胞凋亡能力增強，同時促進細胞的增殖，導致腫瘤的發生。本研究發現，Skp2蛋白表達陽性者中有p27蛋白陽性12例(陽性符合率為44.4%)，Skp2蛋白陰性者中有p27蛋白陰性2例(陰性符合率為15.4%)，Skp2、p27蛋白在骨肉瘤組織中的表達呈負相關關系(r=－0.34，P＜0.05)，與國內外研究結果一致，提示Skp2—p27可能代表了一種致癌通路。由于Skp2在多種腫瘤組織中表達增高，針對Skp2的靶向治療將給許多腫瘤患者帶來希望［15］。近年來多項動物實驗顯示，應用Skp2拮抗劑能使腫瘤細胞凋亡、產生自噬、衰老等［16，17］。而p27在惡性腫瘤中低表達，抑制腫瘤細胞增殖，提示針對Skp2和p27的靶向治療應該是有效的。抑制或者敲除Skp2基因以提高p27蛋白的表達率，可抑制G1/S期的轉換，從而抑制惡性腫瘤的進展，已經在一些惡性腫瘤的治療中得到了證實。因此，檢測Skp2和p27蛋白的表達對骨肉瘤患者腫瘤惡性程度的判斷、治療及預后具有重要意義。

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